[发明专利]两步法培养白术脱毒苗的方法

摘要

一种利用白术营养体通过两步法培养脱毒苗的方法，包括第一步，利用白术顶芽建立无菌培养系：将白术顶芽经消毒后接种于初代培养基，然后转增殖培养，增殖培养可以连续转接，由此建立白术顶芽无菌培养系；第二步，无菌苗茎尖脱毒培养：从建立的无菌培养系中取无菌苗，剥取0.3mm~0.5mm大小的茎尖，接种到诱导培养基，长成的芽苗中有一部分是脱除了病毒的；采用DAS‑ELISA法检测病毒，将含病毒的苗丢弃，不含病毒的苗（即脱毒苗）继续培养；将脱毒苗转接到增殖培养基进行增殖培养；再转接到生根培养基进行生根培养；然后对生根苗进行炼苗移栽。本发明通过两步法培养白术脱毒苗，避免了消毒剂对茎尖的损伤，能将较小茎尖培养成苗，获得脱毒苗。

主权项

1.一种两步法培养白术脱毒苗的方法，其特征在于：包括以下操作流程：1.利用白术顶芽建立无菌培养系：1)白术顶芽初代培养：选取田间生长表现优良的白术植株，剪下包含顶芽的2cm长茎段，去掉叶片，用洗涤剂洗涤干净后放入流水中冲洗30分钟，备用；将备好的材料带入超净工作台，切下顶芽，用75％酒精侵泡30s，无菌水冲洗3次，然后用1％次氯酸钠浸泡15min，期间搅拌，用无菌水冲洗5次，滤纸吸干表面水分，将顶芽接种于盛有初代培养基：MS+6‑BA 0.5mg/l+NAA0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂粉5.5g/l的平底试管，每管1个顶芽，置于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中培养，每日观察，7天后发现部分外植体有污染情况，及时将污染的培养试管清除出培养室，10天后部分外植体开始转绿，部分出现褐化现象，转绿的顶芽经过15天的培养，周围逐渐膨大，基部会形成淡绿色愈伤组织，30天后逐渐分化出3cm～4cm芽苗；2)增值培养：在超净工作台上将初代培养30天获得的芽苗转接到盛有增殖培养基：MS+6‑BA 1mg/l+NAA0.4mg/l+IBA1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂粉5.5g/l的培养瓶中，每瓶接5株苗，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；40天后，统计平均增殖倍率；2.无菌苗茎尖脱毒培养：1)茎尖诱导成苗培养：从建立的无菌培养系中取无菌苗，在超净工作台上用解剖刀和镊子由外向内逐层剥去茎叶和幼叶，直到半圆球的顶端分生组织充分暴露出来，切取0.3mm～0.5mm大小的茎尖，接种到盛有诱导培养基：1/2MS+6‑BA0.5g/l+NAA0.1g/l+蔗糖30g/l+琼脂粉5.5g/l的培养瓶中，每瓶接3个茎尖，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中，每天定时观察，15天后茎尖膨大生长，20天后茎尖生长点出现绿色的芽点突起，25天后芽点长高长大，开始分化成芽，40天后可分化形成1cm～3cm高的芽苗，形成的芽苗中有一部分是脱除了病毒的；2)脱毒苗筛选：茎尖培养45天后，将无菌苗茎尖培养获得的芽苗接种于增殖培养基：MS+6‑BA 1mg/l+NAA0.4mg/l+IBA1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂粉5.5g/l中进行增殖扩繁，40天后将增殖苗从培养瓶移出，剪取0.2g茎叶进行病毒检测；将含病毒的苗丢弃，将不含病毒的苗，即脱毒苗继续培养；3)、脱毒苗增殖培养：在超净工作台上将脱毒苗转接到盛有增殖培养基：MS+6‑BA1mg/l+NAA0.4mg/l+IBA1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂粉5.5g/l的培养瓶中，每瓶接5株苗，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；4)、脱毒苗生根培养：在超净工作台上将增殖培养到4cm的丛生苗分成单株后转接到生根培养基：1/2MS+NAA0.4mg/l+IBA0.6mg/l+蔗糖20g/l+琼脂粉5.5g/l中，每瓶接5株苗，培养于光照12h/天，光强2000lx，温度21±2℃的培养室中；40天后统计生根率；5)、脱毒苗炼苗移栽：取生根培养40d，每株根数≧8条、根长1cm以上的脱毒苗进行练苗移栽，把培养瓶从组培室移至缓冲间，常温闭瓶炼苗3d，半开盖子3d，全开盖3d；完成炼苗后用镊子将白术苗从培养瓶移出，放入清水中，洗净根部琼脂，移栽于基质中，浇透水，每天早晚叶面洒水，以保持湿润，一周后减少洒水次数；一个月后，移栽成活的苗开始长新叶，成活率93％；所述步骤1中的2)增值培养：待苗长满一瓶，继续转增殖培养，1瓶转接10瓶，增殖培养连续转接，由此建立白术顶芽无菌培养系；所述步骤2中的2)脱毒苗筛选：病毒检测方法采用酶联免疫吸附技术‑双抗夹心法DAS‑ELISA，步骤如下：A、准备湿盒：在保鲜盒中放入3～4张湿纸巾，用于保湿及避光；B、准备捕获抗体溶液：按照1:200的稀释比例对捕获抗体进行稀释，稀释液为PH9.6的碳酸盐涂层缓冲液；C、包被板：酶标板中包被抗体，每孔加入100μL捕获抗体溶液；D、孵育板:酶标板放入湿盒，置于4℃冰箱中孵育过夜，放置时间不超过24h；E、洗板：次日，将酶标板孔中溶液倒去，用PBST洗涤液填满反应孔，然后倒尽甩干，润洗3次；F、样品制备：将待检测苗从培养瓶移出，剪取0.2g茎叶置于研钵中，加入2ml的通用提取缓冲液GEB研磨至匀浆状；1000rmp离心10min，取上清液备用；G、加样：将阳性对照，阴性对照，样品溶液分别加入洗过的酶标板中，每孔加入100μL，空白对照孔加100μL的GEB；H、孵育板：将酶标板放入湿盒，于37℃培养箱中孵育2h；I、准备酶联抗体溶液：按照1:200的稀释比例对酶联抗体进行稀释，稀释液为PH9.6的碳酸盐涂层缓冲液；J、洗板：将酶标板孔中溶液倒去，用PBST洗涤液填满反应孔，然后倒尽甩干，润洗7次；K、加酶联抗体：板中每孔加入100μL酶联抗体溶液；L、孵育板：酶标板放入湿盒于37℃孵育2h；M、准备PNPP溶液：需现配现用，将PNPP粉末用缓冲液溶解，终浓度为1mg/ml；N、洗板：将酶标板孔中溶液倒去，用PBST洗涤液填满反应孔，然后倒尽甩干，润洗8次；O、加PNPP溶液：板中每孔加入100μLPNPP溶液；P、孵育板：酶标板放入湿盒于37℃孵育1h，注意避光；Q、结果检测：在酶标仪上，于405nm处，以空白对照孔调零后测各个反应孔的OD值，若大于阴性对照OD值的2倍，则为阳性；所述步骤2中的3)脱毒苗增殖培养：待苗长满一瓶，继续转增殖培养，一般1瓶转接10瓶，增殖培养可以连续转接。