[发明专利]一种C2C12成肌细胞分化培养的方法

摘要

本发明属于成肌细胞的分化培养，涉及一种C2C12成肌细胞分化培养的方法，采用传代五次以上分离得到的小鼠成肌细胞为对象，通过细胞增殖培养、分化培养等步骤，优化生长培养基和分化培养基，传代五次以上的成肌细胞，85%以上的细胞可以分化肌管，可以有效的提高分离得到的原代成肌细胞的利用率。

主权项

一种C2C12成肌细胞分化培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取传代五次以上的C2C12成肌细胞接种于含有生长培养基的培养瓶中，置于 CO2孵箱中培养，孵箱条件为占体积分数 95%空气，5%CO2，温度为37℃，每 48h换液，细胞形态观察使用倒置显微镜；（2）当细胞生长到对数期时，弃去旧培养基，用 PBS缓冲液将细胞洗涤2次，再加入25%胰蛋白酶‑EDTA，覆盖细胞，在倒置显微镜下可观察到细胞消化的情况，当细胞将要分离呈现圆形时，吸去胰酶终止消化，轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入生长培养基，用吸管轻轻吹打数次以打散细胞团块，吸出细胞悬液，放入离心管中，1000rpm离心5min，吸掉上清液，加入适量新鲜生长培养基，用吸管吹打均匀后，按4000个/cm2铺于含有生长培养基的孔板内，置于 CO2孵箱内，占体积分数 95%空气，5%CO2，温度为37℃，每 48h换液，细胞形态观察使用倒置显微镜；（3）待细胞生长至 80%汇合时，撤出生长培养基，加入分化培养基中诱导其进行肌向分化，每48h 更换分化培养液，观察细胞形态使用倒置显微镜；所述的生长培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有 10%胎牛血清，1%双抗，牛蒡子苷8‑10μg/升，EGF0.2‑0.3mg/L，胰岛素100‑200mg/L，地黄多糖30‑50mg/L；所述的分化培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有2%马血清，1%双抗，大豆苷原8‑10μg/升，石榴提取物20‑30mg/L，金银花提取物10‑15mg/L；所述的C2C12成肌细胞采用申请公布号CN103881966A的方法分离得到的小鼠成肌细胞，其方法包括下列步骤：A）将刚离体、并剪碎的小鼠腿部肌肉按体积比1：2 加入分散剂，在37℃颠倒摇动5‑10min，1000rpm 离心5min，去上清，得组织碎片；B）组织碎片中按体积比1：2 加入分散剂，在37℃上下颠倒摇动5‑10min 成浆糊状，按体积比1：10 加入血清以终止酶消化；C）过滤80μm 无菌尼龙网，去除大的组织碎片，滤液1000rpm 离心5min，去上清，得沉淀；D）沉淀置胶原蛋白包被的培养皿中，加原代成肌细胞生长培养基，在37℃，5%CO2 的培养箱中培养；E）当成肌细胞生长到40‑80％丰度时，去原代成肌细胞生长培养基，加原代成肌细胞分化培养基，每天更换原代成肌细胞分化培养基持续培养成肌细胞，直至肌管被诱导形成；其中，分散剂组成是0.2% 胶原酶和0.05% 分散酶，余量为PBS，pH=7.5‑7.8; 原代成肌细胞生长培养基的配制方法是：在80毫升的F10培养基中加入1毫升的青霉素与链霉素的混合液，再加入称量和稀释的碱性成纤维细胞生长因子bFGF，终浓度达到5.0ng/mL，加入19‑20毫升的胎牛血清，混匀，无菌滤膜过滤，滤液保存在4℃；原代成肌细胞分化培养基的配制方法是：将94毫升的DMEM培养基与1毫升的青霉素和链霉素混合液混匀，加入5毫升的马血清，混匀，无菌滤膜过滤，滤液保存在4℃。