[发明专利]一种构建植物中pre‑miRNA5’RACE‑seq文库的方法

摘要

本发明提供了一种构建植物中pre‑miRNA 5’RACE‑seq文库的方法，利用该方法可以明确的看到植物中pre‑miRNA 5’末端碱基的变化情况。本发明通过RNA的提取，加接头，反转录，成环及PCR等方法，成功解决了在5’端难以加接头的技术难题，在植物中创立了用于高通量测序的pre‑miRNA 5’RACE‑seq文库构建新方法。本发明利用SDS‑PAGE分离RNA技术、3’‑RACE接头技术和单链DNA环化等技术。本方法首先在pre‑miRNA建库过程中引入成环技术，解决了接头的添加问题，并能构建出高质量的pre‑miRNA 5’RACE‑seq文库。

主权项

一种构建植物中pre‑miRNA 5’RACE‑seq文库的方法，包括如下：(1)植物总RNA的提取；(2)RNA的准备：利用SDS‑PAGE对所提取的植物总RNA进行分离，对50bp‑400bp之间的RNA进行切胶回收；其特征在于：(3)连接：回收好的RNA的长度集中在50bp‑400bp，通过连接酶在RNA的3’末端特异性的添加接头；(4)反转录：利用反转录试剂盒，对已经加好接头的RNA进行反转录，反转录成cDNA；(5)成环反应：利用成环试剂盒，将已经反转录成功的cDNA首尾相连，变成环状；(6)PCR反应：将成环后的环状cDNA与第一轮引物进行PCR反应，再用PCR产物与第二轮引物进行第二轮PCR反应，这样就能够扩增出来：引物所扩增出来的miRNA。