[发明专利]丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒及其应用

摘要

本发明提供了丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒，包括酶标板、酶标记抗抗体、丁胺卡那霉素标准品、底物显色液、终止液、洗涤液、丁胺卡那霉素抗体，所述酶标板上包被有丁胺卡那霉素半抗原‑蛋白偶联物。本发明公开的试剂盒可定性、定量检测鸡蛋和鸡肉样本中丁胺卡那霉素、卡那霉素的残留。鸡蛋和鸡肉样本中丁胺卡那霉素和卡那霉素的检测方法，首先处理待测鸡蛋和鸡肉样本，然后用酶联免疫试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品定性、定量的检测。

主权项

1.一种丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒，其由酶标板、酶标记抗抗体、丁胺卡那霉素标准品、底物显色液、终止液、洗涤液、丁胺卡那霉素抗体组成，所述酶标板上包被有丁胺卡那霉素-蛋白偶联物，所述丁胺卡那霉素抗体由丁胺卡那霉素-牛血清白蛋白作为免疫原制备得到，所述免疫原通过以下步骤得到：/n称取BSA 20mg使之充分溶解于3mL，pH6.0，0.05mol/LMES缓冲液中，然后迅速加入EDC50mg和NHS50mg，4℃避光，在振荡器中反应12h，得到溶液Ⅰ；称取丁胺卡那霉素标准品50mg，加入1.5mL，pH6.0，0.05mol/LMES缓冲液中，充分溶解，制成丁胺卡那霉素溶液；向溶液Ⅰ中溶液逐滴加入丁胺卡那霉素溶液，边加边搅拌，避光，在4℃下搅拌过夜；过G-25脱盐柱子1次，将脱盐产物装入到处理好的透析袋中，置于0.1mol/L的PBS透析液中，每4h换用一次透析液，透析2天，透析产物分装于1.5mL的离心管中，/n所述酶标板上包被的丁胺卡那霉素-蛋白偶联物由丁胺卡那霉素与卵清蛋白偶联得到，所述丁胺卡那霉素-卵清蛋白偶联物由以下步骤制备得到：/n称取丁胺卡那霉素标准品40mg，溶于2mL的pH8.0，0.05mol/LPB缓冲液中，然后加入0.5%戊二醛溶液 1mL，4℃避光搅拌反应2h，得到溶液Ⅰ，备用；然后，配制0.5% OVA溶液5mL，逐滴滴加溶液Ⅰ，边加边搅拌，再向反应溶液中加入约5.0mg硼氢化钠，于4℃避光搅拌反应2h；过G-25脱盐柱子1次，将脱盐产物装入到处理好的透析袋中，置于0.1mol/L的PBS透析液中，每4h换一次透析液，透析2天，透析产物分装于1.5mL的离心管，/n所述丁胺卡那霉素抗体为丁胺卡那霉素单克隆抗体，由以下步骤制备得到：/n1）动物免疫/n挑选8周龄的Balb/c小鼠，用含有佛氏完全佐剂的丁胺卡那霉素半抗原-牛血清白蛋白偶联物进行皮下注射，免疫剂量为200mg/只，第2，4和8周加强免疫，最后一次免疫在第12周，使其产生多克隆抗体血清，/n2）骨髓瘤细胞和脾细胞的制备/nSP2/0骨髓瘤细胞采用常规的RPMI-1640培养液培养，使细胞处于对数生长期，制成SP2/0骨髓瘤细胞细胞悬液；取经免疫的小鼠脾脏，破碎，过400目的不锈钢纱布过滤制成脾细胞悬液，计数后备用，/n3）细胞融合和单克隆化/n将1×10⁸-3×10⁸ SP2/0骨髓瘤细胞和4×10⁸脾细胞在PEG6000作用下进行融合，对于分泌抗体培养孔，采用间接竞争ELISA测定以筛选阳性孔，采用有限稀释法对阳性孔进行单克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，/n4）细胞冻存和复苏/n将丁胺卡那霉素的单克隆杂交瘤细胞株成1×10⁶-3×10⁶个/mL的细胞悬液，每个冻存管500mL，先在-4℃放置2h，-20℃放置2h，-50℃放置2h，再保存在液氮中，复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，转入锥形瓶中，加入10-15mL完全培养液中，使用CO₂培养箱进行培养，/n5）单克隆抗体的大量生产与纯化/n取健康的Balb/c雌鼠，腹腔注入降植烷0.5mL/只，7天后腹腔注射丁胺卡那霉素的单克隆杂交瘤细胞株2×10⁵-5×10⁵个/只，隔天观察，15天后采集腹水，先用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水初步纯化，后采用DEAE-纤维柱子进行离子交换层析，纯化后抗体-20℃保存，/n所述酶标记抗抗体由羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶采用马来酰亚胺基类活泼酯法偶联得到，/n所述丁胺卡那霉素标准品溶液的浓度分别为0mg/L，0.5mg/L，1.5mg/L，4.5mg/L，13.5mg/L，40.5mg/L，/n所述洗涤液为含有0.5-1.5‰ Triton X-100和0.5‰ Proclin300防腐剂的Tris缓冲液，其中，Tris缓冲液浓度为0.05mol/L, pH为8.0，所述千分比均为体积比，/n所述酶标板制备用0.05mol/L，pH8.0磷酸盐包被液或0.05mol/L pH8.0 磷酸盐包被液将丁胺卡那霉素-卵清蛋白稀释成0.05-0.15mg/ml，每孔加入100ml，37℃温育2h或4℃过夜，用洗涤液洗涤2次，拍干，然后再每孔中加入含有0.5%卵清蛋白、3%小牛血清的0.05mol/L，pH7.0的硼酸缓冲液300mL进行封闭，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存，百分比为重量百分比。/n