[发明专利]一种新型β-淀粉酶的高效制备方法

摘要

本发明提供了一种新型β‑淀粉酶的高效制备方法。根据大麦β‑淀粉酶编码基因bba碱基序列和酿酒酵母的密码子偏好性，对上述bba基因进行密码子优化并全基因合成新的bbaP基因，并通过非高保真的DNA聚合酶在低退火温度下（45~50℃）对上述获得bbaP实施易错PCR，获得的新基因bbaPT克隆入pPIC9K载体中构建重组表达质粒pPIC‑bbaPT，在巴斯德毕赤酵母GS115中实现整合表达，筛选获得了最适作用温度显著提高的β‑淀粉酶的重组菌。获得重组β‑淀粉酶的最适作用温度为65℃，最适作用pH为5.0，最高酶活力达280 U/mL。

主权项

一种新型β‑淀粉酶的高效制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：（1）β‑淀粉酶基因的获得：通过NCBI公布的大麦β‑淀粉酶编码基因bba碱基序列和酿酒酵母的密码子偏好性，对上述bba基因进行密码子优化并全基因合成新的bbaP基因；（2）克隆：将步骤（1）所得bbaP基因克隆入pPIC9K载体中构建重组表达质粒pPIC‑bbaP；（3）易错PCR：采用非高保真的DNA聚合酶在45~50℃低退火温度下对上述获得bbaP实施易错PCR，获得的新基因bbaPT；（4）表达：将步骤（3）所得新基因bbaPT克隆入pPIC9K载体中构建重组表达质粒pPIC‑bbaPT，在巴斯德毕赤酵母GS115中实现整合表达；（5）耐热新型β‑淀粉酶的筛选：通过His+筛选、淀粉透明圈筛选及G418抗性筛选，再通过摇瓶发酵和酶活测定获得最适作用温度显著提高的β‑淀粉酶的重组酵母GS‑bbaPT29；（6）耐热新型β‑淀粉酶的发酵生产：发酵培养，分离纯化得到耐热新型β‑淀粉酶。