[发明专利]一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法

摘要

本发明公开了一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，以铜绿假单胞菌特有的ETA保守序列为靶基因序列，设计一套LAMP特异性引物，对纺织品样品增菌后产物进行LAMP扩增，扩增后的产物形成白色沉淀，通过对比观察可判定结果，或通过浊度仪观察结果，样品反应浊度值小于0.1时，可判定该样品结果为阴性，样品反应浊度值大于或等于0.1时，可判定该样品结果为阳性。对判定为阳性样品增菌液接种平板分离，挑取平板上典型或可疑菌落，利用MALDI‑TOF‑MS技术鉴定快速鉴定出结果。本方法操作简单，快速、高效、特异性强，灵敏度高，结果观察方便、直观。

主权项

一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤：步骤一：样品增菌用无菌的方式取样、增菌培养，得增菌液；步骤二：LAMP试验2.1)DNA模板的制备：取增菌液放入灭菌Eppendorf管内，高速冷冻离心机离心处理，除去杂质，获得DNA模板；2.2)LAMP扩增反应2.2.1)扩增准备：根据样本数量设定所需要的LAMP反应管数n(n＝1管空白对照+1管阴性对照+1管阳性对照+样本数)，取出n个LAMP反应管；扩增反应体系见表1，按表1计算好各试剂的使用量，按表1的顺序加入灭菌离心管中，混合混匀，2000r/min离心10sec，向设定的n个LAMP反应管中分别加入23μL；表1 反应体系2.2.2)设定空白对照、阴性对照、阳性对照每次反应均设置阴性对照、空白对照和阳性对照；空白对照：以水代替DNA模板；阴性对照：以水代替样品，按步骤2.1)提取模板DNA作为LAMP反应的模板；阳性对照：铜绿假单胞菌标准菌株增菌后按2.1)提取模板DNA作为LAMP反应的模板；2.2.3)加样将步骤2.1)制备好的DNA模板、步骤2.2.2)中的空白对照、阴性对照、阳性对照各取2μL加入相应的反应管中，使反应体系达到25μL；盖紧管盖，混匀，2000r/min离心10sec；2.2.4)上机反应将步骤2.2.3)离心后的反应管置于水浴锅或LAMP实时浊度仪中，63℃扩增40min；2.2.5)初步观察结果2.2.5.1)可视化观察结果反应结束后取出反应管，将反应管置于黑色背景下观察；先观察对照反应管，有白色沉淀者为阳性，无白色沉淀者为阴性；如果结果为阴性，可直接报告样品中未检出铜绿假单胞菌，如结果为阳性或可疑，继续进行步骤三的鉴定；2.2.5.2)浊度仪结果反应结束后，观察LAMP实时浊度仪生成的扩增曲线，空白对照、阴性对照无扩增曲线，反应浊度值小于0.1，阳性对照有典型扩增曲线且反应浊度值大于0.1，否则实验视为无效；样品反应浊度值小于0.1时，可判定该样品结果为阴性；样品反应浊度值大于或等于0.1时，可判定该样品结果为阳性；步骤三：MALDI‑TOF‑MS技术鉴定3.1)分离取步骤2.2.5)初步观察结果为阳性的样品的增菌培养液，用一次性接种环，从培养液的薄菌膜下方挑取培养物，划线接种在一个假单胞菌CN选择性培养基平板上，置36℃±1℃培养24h±2h；铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素；挑取2个或2个以上假单胞菌CN选择性培养基平板上典型或可疑菌落，通过MALDI‑TOF‑MS技术鉴定可疑菌落指纹谱图，利用MALDI Biotyper System分析对比得出最终鉴定结果；3.2)MALDI‑TOF‑MS技术鉴定确认3.2.1)配制标准品和基质配置标准品和基质的标准溶剂为50％乙腈+47.5％水+2.5％三氟乙酸；标准品配制：取出MALDI Biotyper System专用的标准品(Bacterial Test Standard，BTS)，加入标准溶剂50μL；使用移液器反复吹吸的方式，溶解BTS粉末；室温放置5min之后重复吹吸，13000r/min离心2min，备用；基质配制：取出MALDI Biotyper System专用的基质HCCAportioned，加入250μL标准溶剂，振荡混匀，直到形成澄清溶液；3.2.2)MALDI BioTyper自动鉴定挑取假单胞菌CN选择性培养基平板上单个菌落均匀涂抹于靶板靶孔内，加1μLHCCA基质溶液覆盖上述样品点，室温下晾干；将靶板放入MALDI BioTyper自动鉴定仪，MALDI Biotyper System分析过程中同时采集样品质谱图，由FlexControl3.0得到蛋白峰信息，自动鉴定结果；步骤四：结果报告根据步骤二试验，初步判定样品中铜绿假单胞菌检测结果；初步结果为阴性，可直接报告样品中未检出铜绿假单胞菌，如初步结果为阳性或可疑，按步骤三进行确认，报告样品中检出或未检出铜绿假单胞菌。