[发明专利]一种检测并定位甘蔗宿根矮化病致病菌LXX的方法

摘要

本发明涉及一种检测并定位甘蔗宿根矮化病致病菌LXX的方法，包括冰冻切片、预处理、原位PCR、免疫组化、观察检测。本发明所述的检测并定位甘蔗宿根矮化病致病菌LXX的方法，相对于构建携带GFP的LXX工程菌转化甘蔗来探究LXX菌的定植，可以对染甘蔗宿根矮化病的甘蔗病株冰冻切片中LXX特异性核酸进行定位的间接原位PCR，能够较快地实现LXX菌的检测，并探究LXX组织定位，且无需考虑构建、转化工程菌的低效率，高消耗，技术要求高等问题；本发明所述的方法，有效回避了目前所面临的LXX菌较难体外纯培养、多抗特异性较低、单抗制备难度较大等问题，成功实现了快速、准确地检测并定位甘蔗宿根矮化病致病菌LXX。

主权项

1.一种检测并定位甘蔗宿根矮化病致病菌LXX的方法，其特征在于：包括以下步骤：冰冻切片：取甘蔗组织，置于冰上操作，进行固定、包埋和切片，得到组织切片；预处理：将上步得到的组织切片置于载玻片上，用脂质打孔剂冰上浸没处理，之后用PBS洗涤，再用溶菌酶溶液浸没处理,最后用PBS洗涤，得到预处理的组织切片；原位PCR：将上步得到的预处理的组织切片恒温加热，进行原位PCR反应，之后将PCR反应液吸掉，用PBS洗涤后吸净，得到反应后的组织切片；免疫组化：向反应后的组织切片加入封闭液进行冰上孵育，冰上孵育的时间为30min，之后加入抗体室温孵育，室温孵育的时间为1h，然后将抗体移除，用洗脱缓冲液洗片，最后加入碱性磷酸酶底物置于暗盒中显色，得到免疫组化的组织切片；观察检测：不加盖玻片，每隔10min在显微镜下对上步得到的免疫组化的组织切片进行镜检，看着色情况，镜检时间为30‑60min；一旦发现组织着色，就吸掉抗体底物，并用洗脱缓冲液洗涤，无菌水洗一次，然后吸掉所有的水后加入甘油溶液封片，组织切片上出现蓝紫色的部位为LXX富集部位。