[发明专利]鸡冠菜小孢子培养方法

摘要

本发明公开了一种鸡冠菜小孢子培养方法，包括以下步骤：摘取0.3～0.5cm大小的鸡冠菜花蕾，制备成小孢子悬浮液；将小孢子悬浮液利用诱导胚状体培养基培养获得胚状体，将胚状体利用植株再生培养基培养成试管苗，将试管苗切除周围愈伤组织后直接移入增殖培养基进行增殖培养，所得的丛生小苗Ⅱ重复上述增殖培养，从而实现继代增殖培养；将切除周围愈伤组织后的试管苗直接增殖培育成3.0～5.0cm高，然后转入生根培养基进行培育；或者将丛生小苗Ⅱ在增殖培养基中增殖培育成3.0～5.0cm高，割取单株小苗后转入生根培养基进行培育；待生根培养基上的苗长出3～5片叶子并形成根系后，得到可移栽植株。

主权项

1.鸡冠菜小孢子培养方法，其特征是依次包括以下步骤：1)、从鸡冠菜主花序、一次分枝花序上摘取0.3～0.5cm大小的花蕾，置4±0.5℃冷藏72±2小时，然后将冷藏的花蕾取出后用水冲洗；2)、取步骤1)所得的15～20枚水冲洗后的花蕾消毒、无菌水冲洗后，加入5mL 的NLN培养液，挤压花蕾，匀浆，过滤，滤液离心，去上清液，在所得的沉淀中加入15mL ～18mL NLN培养液；再重复上述过滤、滤液离心，去上清液；在第二次离心所得的沉淀中加8ml诱导胚状体培养基，得小孢子悬浮液；3)、取步骤2)所得小孢子悬浮液0.5mL 于培养皿中，加入3±0.5mL 的诱导胚状体培养基，再加入0.2mL ～0.3mL 混合活性碳，混匀后密封培养皿置于32±1℃的恒温箱中黑暗培养72±2小时，之后移至25±1℃进行暗培养，当肉眼可见胚状体时，将培养皿移至摇床于25±1℃继续黑暗培养；所述混合活性碳的制备方法为：将1g的活性碳溶解于50±2mL 诱导胚状体培养液中；步骤2)、步骤3)的诱导胚状体培养基为：改良NLN基础培养基+2,4‑D 0.02～0.05mg/L+蔗糖130g/L，pH为6.0；每L改良NLN基础培养基由以下含量的成分组成：125mg KNO3、125mg MgSO4·7H2O、125mg KH2PO4、500mg Ca(NO3)2·4H2O、22.3mg MnSO4 ·4H2O、6.2mg H3BO3、8.6mg ZnSO4·7H2O、0.25mg Na2MoO4·2H2O、0.025mg CuSO4·5H2O、0.025mg CoCl2·6H2O、0.83mg KI、30mg谷胱甘肽、100mg L‑serine、0.5mg Thiamine HCl、5mg Nicotinic Acid、0.5mg Pyridoxine HCl、2mg Glycine、0.05mg Biotin、0.5mg Folic Acid、100mg Myo‑inositol、800mg谷氨酰胺、27.8mg FeSO4·7H2O、37.3mg Na2·EDTA；余量为水；4)、将步骤3)摇床培养15～20d后的胚状体移入植株再生培养基中，于25±1℃进行光培养，光照时间12h·d‑1，光强为30～40μmol·m‑2·s‑1，培养3～4周后胚状体分化成试管苗；上述光照和暗培养交替进行；暗培养时的温度控制在22±1℃；所述植株再生培养基为1/4MS基础培养基+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8；5)、将步骤4)所得试管苗切除周围愈伤组织后直接移入增殖培养基中，继续25±1℃光培养，光照时间12h·d‑1，光强为30～40μmol·m‑2·s‑1；上述光照和暗培养交替进行；暗培养时的温度控制在22±1℃；当增殖培养基中培养所得的小苗Ⅰ诱导出不定芽且小苗Ⅰ长到2.0～3.0cm高时结束上述增殖培养，以2～3株不定芽为一丛进行割取作为丛生小苗Ⅱ；6)、以丛生小苗Ⅱ替代切除周围愈伤组织后的试管苗，重复上述步骤5)，从而实现继代增殖培养；步骤5)、步骤6)增殖培养基为MS基础培养基+6‑BA 0.2～0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8；7)、在步骤5)中，将切除周围愈伤组织后的试管苗直接增殖培育成3.0～5.0cm高，然后转入生根培养基进行培育；或者将丛生小苗Ⅱ在增殖培养基中增殖培育成3.0～5.0cm高，割取单株小苗后转入生根培养基进行培育；待生根培养基上的苗长出3～5片叶子并形成根系后，得到可移栽植株；培养条件：25±1℃光培养，光照时间12h·d‑1，光强为30～40μmol·m‑2·s‑1，光照和暗培养交替进行，暗培养时的温度控制在22±1℃；所述生根培养基为1/2MS基本培养基+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8。