[发明专利]使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻矮杆基因SD1的方法

摘要

本发明公开了一种使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻矮杆基因SD1的方法，根据CRISPR/Cas9的设计原则，在水稻SD1基因编码区确定CRISPR/Cas9系统编辑的靶位点，根据靶位点的序列设计引物，构建CRISPR/Cas9载体，用农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织，通过筛选鉴定，最后获得SD1突变的不含转基因DNA片段的矮杆水稻品系。该方法应用于矮杆水稻品种的选育，可以免去杂交选育的工作，大大缩短矮杆品种选育的周期。

主权项

使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻矮杆基因SD1的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)选择SD1基因编码区第108至127核酸序列作为CRISPR/Cas9系统的靶序列(SEQ ID NO.1)：AGGATGGAGCCCAAGATCC；根据靶序列设计两条单核苷酸引物：SD1‑F1(SEQ ID NO.2)：TGTGTGAGGATGGAGCCCAAGATCCSD1‑R1(SEQ ID NO.3)：AAACGGATCTTGGGCTCCATCCTCA；b)将单核苷酸引物SD1‑F1和SD1‑R1混合，通过退火反应形成二聚体结构，然后与载体片段BGK03进行连接，构建得到含有水稻SD1基因靶序列的质粒BGK03‑SD1；c)用含有BGK03‑SD1质粒的根癌农杆菌EHA105侵染水稻的愈伤组织，通过潮霉素筛选，再生获得转基因水稻植株；d)利用如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的水稻SD1基因的特异引物，扩增基因组片段进行测序，筛选突变植株；SEQ ID NO.4：GGGTCATTGATTCGACCATCSEQ ID NO.5：GTGCTCGGACACCTGGAAGAAC。