[发明专利]人羊膜上皮干细胞库的构建方法

摘要

本发明涉及一种人羊膜上皮干细胞库的构建方法。其方法是取人羊膜，用胰蛋白酶消化后，过滤制成单细胞悬液；在DMEM／F12培养基中添加人表皮细胞生长因子、人转铁蛋白、人胰岛素、亚硒酸钠、丙氨酰‑L‑谷氨酰胺二肽、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸，使细胞在无血清条件下，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，换液和传代。将体外培养和扩增获得细胞置液氮冷冻保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建人羊膜上皮干细胞库。本发明储存人羊膜上皮干细胞，其具有来源广泛、不受伦理限制的特点，细胞培养和储存介质无动物源性。可提供上皮干细胞进行细胞治疗及其他应用。

主权项

一种人羊膜上皮干细胞库的构建方法，其特征是包括下述步骤：（1）人羊膜的选材严格遵循供体符合医学标准并建立资料档案；（2）人羊膜收集及检测取供体符合医学标准剖腹产或正常分娩的胎膜，在胎膜娩出5～10分钟内，从胎膜上钝性分离羊膜；进行ABO/Rh血型检测及HLA分型检测和微生物学检测，用磷酸盐缓冲液PBS或0.9%生理盐水反复漂洗后剪碎；用含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸盐缓冲液或0.9%生理盐水浸泡20～40分钟；（3）人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备取人羊膜先用终浓度 2.5g/L胰蛋白酶，室温消化30～60分钟，共2～4次，得到细胞悬液；用200目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～10分钟，用PH 7.2磷酸缓冲液PBS洗2次；再离心，离心机的转速为1500转/分钟～2500转/分钟，时间为15分钟～30分钟，弃去上清液，即获得羊膜上皮干细胞；（4）人羊膜上皮干细胞的无血清培养、纯化及扩增将第(1)步所得细胞以2.5×l07 L‑1～2.5×l010 L‑1密度接种于无血清培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，根据细胞生长情况，每24小时～48小时全量换液一次，待细胞达到80％～90％融合时，用终浓度2.5g/L胰蛋白酶消化，然后按1：2的比例或l：3的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每24小时～48小时全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代培养，并记为P2代，继续上述传代培养过程使人羊膜上皮干细胞逐渐得到扩增和纯化；所述无血清培养基采用DMEM／F12按体积1:1混合15.0～15.6g/L表皮细胞生长因子0.005～0.015 mg/L人转铁蛋白1.0～7.0 mg/L人胰岛素5.5～15 mg/L亚硒酸钠5.0～7.2×103 mg/LL‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺二肽300～500 mg/LL‑丙氨酸10～25 mg/LL‑天冬酰胺4.9～10.9 mg/LL‑天冬氨酸9.3～17.3 mg/LL‑谷氨酸10.7～18.7 mg/L甘氨酸5.5 ～8.5 mg/LL‑脯氨酸 7.5～15.5 mg/LL‑丝氨酸6.5～11.5 mg/L在上述第(4)步中，择优选择将第(3)步所得细胞以2.5×l07 L‑1‑2.5×l010 L‑1密度接种于上述无血清培养基中培养；（5）人羊膜上皮干细胞库的构建取培养P2～3代人羊膜上皮干细胞保存于无血清培养液加10%二甲基亚砜DMSO中，细胞浓度调整至1×10 5个/ml～1×10 8个/ml,分装于冷冻管中，标记冻存日期，置液氮冷冻；液氮冷冻温度为‑196 ℃；按其新生儿性别和ABO/Rh分型及HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人羊膜上皮干细胞库；（6）人羊膜上皮干细胞复苏羊膜上皮干细胞复苏方法 于60 ℃恒温水浴箱中，0.5～1 min内快速复苏，按2.5×103/cm2～2.5×105/cm2接种于塑料培养瓶内，用含DMEM/F12无血清培养基中培养，按1:3传代，扩增后获得大量人羊膜上皮干细胞，备用。