[发明专利]一种检测小分子物质的银纳米粒子消光免疫层析试纸条

摘要

一种检测小分子物质的银纳米粒子消光免疫层析试纸条。本发明属分析检测领域，公开了检测小分子物质的免疫层析试纸条：将修饰牛血清白蛋白的荧光物质分别与检测抗原以及抗免疫球蛋白G抗体混合，喷涂在试纸条特定区域上做为检测线及质控线，标记特异性单克隆抗体的银纳米粒子(银消光探针)喷涂在试纸条结合垫。当样品溶液不存在待测物时，银消光探针与检测线上检测抗原结合，吸收了荧光物质的激发光或发射光而使检测线无荧光，而质控线有荧光；当样品溶液存在待测物时，银消光探针优先与待测物结合，此时结合在检测线上的银消光探针数量减少，而结合在质控线上的银消光探针数量增加，导致试纸条检测线荧光增加，而质控线荧光下降。本发明较传统免疫层析试纸条检测小分子物质的消线判读模式更灵敏。

主权项

1.一种检测小分子物质的银纳米粒子消光免疫层析试纸条，其特征是制备方法为：（1）荧光物质与牛血清白蛋白简称BSA通过羧基和氨基间共价键结合：所选用的荧光物质为荧光微球、量子点微球、量子点或荧光染料；荧光物质需先经过表面氨基或羧基修饰，再与BSA上的羧基或氨基通过1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐简称EDC活化共价结合，得荧光物质‑BSA；荧光物质的最适激发波长和最大发射波长二者至少其一在400 nm至500 nm之间；（2）制备银消光探针：1）采用种子逐步生长法合成银纳米粒子，对每一步的银粒子测定紫外吸收峰，当峰值达到与所选用的配对荧光物质的最大激发波长或发射波长一致时停止生长；具体方案为a）银种子制备：在100 mL体系中调整柠檬酸钠简称SC浓度至5 mM，单宁酸简称TA 0.1 mM，加热剧烈搅拌，一开始沸腾，立即加入1 mL 25 mM AgNO3，溶液马上变成亮黄色，补足体系体积至100 mL，得到种子银大小约15 nm的种子银溶液；b）银粒子逐步生长：在100 mL体系中移除19.5 mL反应液，加入16.5 mL水，温度设定到90℃，加入0.5 mL 25 mM SC，1.5 mL 2.5 mM TA，1 mL 25 mM AgNO3，补足体系体积至100 mL，搅拌30 min。重复“移除19.5 mL反应液，加入16.5 mL水，0.5 mL 25 mM SC，1.5 mL 2.5 mM TA和1 mL 25 mM AgNO3，补足体系体积至100 mL，90℃搅拌30 min”这一过程，紫外扫描监测银纳米粒子 SPR吸收峰的变化情况，直到获得SPR吸收峰与配对荧光材料的最大激发波长或发射波长相同，得银纳米粒子；2）银纳米粒子与待检小分子单克隆抗体结合：取1mL 银纳米粒子溶液，粒子数为1010至1012，5000转至10000转离心10 min，弃上清；沉淀重悬于1 mL含待检小分子抗体的0.1 M硼酸溶液，其中IgG含量1 μg至80 μg，用NaOH调整pH到7.0至7.5；20℃磁力搅拌器上搅动2 h，5000转至10000转离心10 min，弃上清；沉淀重悬于pH 7.0至7.5 含0.1%（w/v）BSA的0.1M硼酸溶液中，5 min后，5000转至10000转离心10 min，沉淀重悬于0.25 mL pH 7.0至7.5 含0.1%（w/v）BSA的0.1M硼酸溶液中，得银消光探针，4℃保存备用；（3）检测抗原制备：将小分子待测物与BSA通过共价键结合；先活化小分子待测物上非抗体识别位点的基团，然后与BSA分子上氨基或羧基通过共价键结合得小分子待测物‑BSA；该方法与制备小分子人工抗原的方法相同；（4）银纳米粒子消光免疫层析试纸条的组装：试纸条包括滤纸、样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜简称NC膜和吸水纸五部分组成；其中滤纸、样本垫与结合垫层叠组装在NC膜一端，吸水纸层叠在NC膜另一端，五部分整体固定在粘性卡纸上；其中结合垫上承载银消光探针，每个试纸条结合垫固定探针数量为106至108个；检测线上固定待检小分子的检测抗原和荧光物质‑BSA，每个试纸条检测线上固定小分子检测抗原0.1 μg至0.5 μg；质控线上固定抗IgG抗体即二抗和荧光物质‑BSA，每个试纸条质控线上固定抗IgG抗体10 ng至100 ng；检测线和质控线上固定荧光物质‑BSA的量均以荧光物质质量计算为1 ng至50 ng；距离检测线4.0 mm 至6.0 mm处喷涂质控线；切割成宽度3.8 mm每条，装入试纸条卡盒中，卡盒与常规的胶体金速测卡盒相同，内有试纸条固定卡槽，在试纸条的滤纸位置留有加样孔，在NC膜上检测线和质控线位置留有检测窗口；试纸条检测卡与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。