[发明专利]一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法

摘要

本发明公开了一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法，具体步骤为：骨髓悬液备用，取患者外周血,密封备用；自体血清，分装待用；将骨髓悬液梯度离心；得到细胞悬液；将细胞悬液培养箱中培养；再用0.5ml生理盐水重悬细胞；取一块牛源Ⅰ型胶原蛋白膜，将细胞悬液滴注于牛源Ⅰ型胶原蛋白膜中；将牛源Ⅰ型胶原蛋白膜浸泡于生理盐水中，然后置于37℃，5%的CO2培养箱中孵育6h，即可。本发明具有治疗效果好等优点。

主权项

一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法，其特征在于：具体步骤为：（1）、无菌条件下，采用内含1ml肝素钠生理盐水的20ml注射器抽出患者的自体骨髓9ml,去针头后，加入含10ml DMEM高糖培养基的培养瓶中，混匀后，得到骨髓悬液备用，然后在无菌条件下，取患者外周血100‑200ml，置于血袋中，密封备用；（2）、将外周血置于50ml离心管中，在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，再将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，制备得到自体血清，分装待用；（3）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，在2000rpm的条件下，梯度离心20min；（4）、吸取中间白膜层，加入50ml PBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，然后加入50mlPBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，加入20ml DMEM高糖培养基，吹打计数，得到细胞悬液；（5）、将细胞悬液分装于5个含24ml DMEM高糖培养基的T175培养瓶中，置于37℃，5%的CO2培养箱中培养；（6）、第4天更换一次培养液，以后每三天更换一次DMEM高糖培养基，该DMEM高糖培养基中也含5 ng/ml FGF‑2、10%自体血清、硫酸庆大霉素40U/ml；（7）、第13天，向未传代的细胞培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶‑EDTA溶液，胰蛋白酶‑ EDTA 溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶‑ EDTA 溶液中的EDTA 的质量浓度为0.01%，置于37℃，5%的CO2温箱2‑3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖DMEM培养基终止消化；（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，在1200rpm的条件下，再将细胞悬液离心7min，再用生理盐水洗3次；（9）、再用0.5ml生理盐水重悬细胞；（10）、取一块牛源Ⅰ型胶原蛋白膜，将细胞悬液滴注于牛源Ⅰ型胶原蛋白膜中，细胞密度为1×106/cm2；（11）、将牛源Ⅰ型胶原蛋白膜浸泡于生理盐水中，然后置于37℃，5%的CO2培养箱中孵育6h，即可。