[发明专利]汞离子食品污染中直接竞争酶联免疫检测试剂盒及其应用

摘要

本发明提供了一种基于直接竞争酶联免疫法汞离子检测试剂盒，包括：包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为50～200μg/mL；质量浓度为20～50μg/mL的酶标Hg‑ITCBE鳌合物半抗原；质量浓度为10～20μg/mL的抗汞离子单克隆抗体溶液；所述抗汞离子单克隆抗体溶液由Hg‑ITCBE‑cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制备而来；1.0～3.0mol/L的终止液；样品稀释液；底物显色液；洗涤液；汞离子标准品溶液；质量浓度为10～20mg/mL的EDTA处理液。本发明提供试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时具有检测时间短的优点。

主权项

1.一种基于直接竞争酶联免疫法汞离子检测试剂盒，包括：(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为80～150μg/mL；(2)质量浓度为30～40μg/mL的酶标Hg‑ITCBE鳌合物半抗原溶液；(3)质量浓度为13～18μg/mL的抗汞离子单克隆抗体溶液；所述抗汞离子单克隆抗体溶液由Hg‑ITCBE‑cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制备而来；(4)1.0～3.0mol/L的终止液；(5)样品稀释液；(6)底物显色液；(7)洗涤液；(8)汞离子标准品溶液；(9)质量浓度为10～20mg/mL的EDTA处理液；所述样品稀释液为质量浓度为2～10g/L的HEPES缓冲液；所述洗涤液为包含质量浓度0.05～0.1％Tween 20的PBS溶液；所述Hg‑ITCBE‑cBSA免疫原的制备方法包括以下步骤：(1)将ITCBE和二甲基亚砜按照ITCBE的质量和二甲基亚砜的体积比为(8～12)mg∶1mL混合，形成金属鳌合剂溶液；(2)将硝酸汞Hg(NO₃)₂与HEPES缓冲液按照11.25mg∶1mL的比例混合，形成Hg²⁺溶液；(3)将所述步骤(1)中得到的金属鳌合剂溶液和所述步骤(2)中得到的Hg²⁺溶液按照体积比为1∶1混合，调节混合液pH值至7.0，然后在23～27℃条件下振荡反应10～14h，形成Hg‑ITCBE鳌合物半抗原；(4)将BSA、EDC与PBS缓冲液混合搅拌得到混合液，BSA质量、EDC质量与PBS缓冲液的体积比为66mg∶11.6mg∶5mL，将所述混合液与乙二胺按照混合液体积和乙二胺质量比为5mL∶7mg的比例混合，37℃振荡反应2h得反应液；反应液用PBS透析4d，得到活化的载体蛋白BSA；(5)将所述活化的载体蛋白BSA和pH值为8.0的HEPES缓冲液混合，形成浓度为30mg/mL的载体蛋白溶液；(6)将所述步骤(3)中得到的Hg‑ITCBE鳌合物半抗原溶液和所述步骤(5)得到的载体蛋白溶液按照体积比为1∶1的比例混合，调节pH值至9.0，23～27℃条件下振荡反应22～26h，将得到的反应液装入透析袋，先用蒸馏水透析2d，再用PBS透析3d，即形成Hg‑ITCBE‑cBSA免疫原；所述酶标Hg‑ITCBE鳌合物半抗原的制备方法，包括以下步骤：A.将ITCBE与二甲基亚砜混合形成金属鳌合剂溶液；B.将硝酸汞Hg(NO₃)₂与HEPES缓冲液混合，形成Hg²⁺溶液；C.将所述步骤A中得到的金属鳌合剂溶液和所述步骤B中得到的Hg²⁺溶液混合，调节混合液的pH值至7.0～7.2，得到的混合液振荡反应10～14h，形成Hg‑ITCBE鳌合物半抗原；D.将标记用酶与HEPES缓冲液混合，得到酶溶液；E.将所述步骤C得到的Hg‑ITCBE鳌合物半抗原溶液与所述步骤D中得到的酶溶液混合，调节混合物的pH值至8.8～9.2，再将混合液振荡反应22～26h，得到酶标Hg‑ITCBE螯合物半抗原；所述步骤A与B之间没有时间顺序的限制；C和D之间，D与A和B之间同样没有时间顺序的限制。