[发明专利]一种治疗脊髓损伤药物的实验方法

摘要

本发明公开了一种治疗脊髓损伤药物的实验方法，采用富氢生理盐水联合甲基强的松龙对SCI进行治疗，通过比较大鼠神经功能恢复，观察损伤脊髓神经细胞形态学变化及细胞凋亡情况，探索联合治疗的有效性，使富氢生理盐水联合甲基强的松龙疗法成为SCI新的治疗方法。记录和分析MBI及ASIA评分，验证富氢生理盐水联合甲基强的松龙疗法在临床上的应用效果。本发明为富氢生理盐水联合甲基强的松龙疗法在治疗脊髓损伤的实际应用中获取证据。为脊髓损伤提供一种更为有效的治疗方法。

主权项

一种治疗脊髓损伤药物的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、动物实验部分1)分组：(1)Sham组n＝12：假损伤组(2)急性SCI动物模型n＝36：制作大鼠急性SCI动物模型之后，随机分成四组，即MP组n＝12、MP+H2治疗组n＝12及NS组n＝12；2)动物模型的制作：(1)假损伤组n＝12：10％水合氯醛麻醉大鼠，于大鼠脊柱T9‑T12水平正中切口纵形切开，分离脊柱骨膜，暴露T10椎骨，用高速磨钻磨除椎骨嵴突，暴露椎管硬脊膜，注意保持硬膜完整；术后缝合创口；(2)急性SCI动物模型n＝36：采用精确损伤撞击器制作大鼠急性SCI动物模型；10％水合氯醛麻醉大鼠，于大鼠脊柱T9‑T12水平正中切口纵形切开，分离脊柱骨膜，暴露T10椎骨，用高速磨钻磨除椎骨嵴突，暴露椎管硬脊膜，注意保持硬膜完整；将大鼠固定于立体定位仪上；将撞击锤安置于椎管窗内，紧贴硬模；采用颅脑损伤撞击器，建立中度损伤的可控性皮质打击伤模型，打击条件为：撞击速度为2m/s，撞击深度为2.5mm，接触时间为85ms；术后缝合创口；3)富氢生理盐水的制备：0.4MPa高压下将氢气溶于生理盐水，持续6h；制备后的饱和氢盐水经γ射线灭菌后，于标准大气压下4℃冰箱保存；氢盐水每周补充氢气，使用前按照Ohaswa描述的方法进行气相色谱分析检测饱和氢盐水浓度，以保证其浓度＞0.6mmol/L；4)改良大鼠神经功能缺损评分mNSS：共计18分，分数越高，神经系统功能损害越严重；其中包括：提尾试验3分；将大鼠放置于地板上，正常值＝0；最大值＝3；感觉试验共计2分；平衡木试验，正常值＝0；最大值＝6；反射丧失和不正常运动共计4分；5)急性SCI的治疗干预：(1)Sham组n＝12：无任何治疗；(2)MP+H2治疗组n＝12：采用富氢生理盐水联合甲基强的松龙对急性SCI进行治疗；急性SCI动物模型制作成功并分组后，立即给予甲基强的松龙20mg/10ml+富氢生理盐水10ml于大鼠进行静脉泵入，此后每天给予相同剂量进行静脉泵入，治疗1周；(3)MP组n＝12：采用甲基强的松龙对急性SCI进行治疗；急性SCI动物模型制作成功并分组后，立即给予甲基强的松龙20mg/10ml于大鼠进行静脉泵入，此后每天给予相同剂量进行静脉泵入，治疗1周；(4)NS组n＝12：采用生理盐水对急性SCI进行治疗；急性SCI动物模型制作成功并分组后，立即给予生理盐水10ml于大鼠进行静脉泵入，此后每天给予相同剂量进行静脉泵入，治疗1周；6)大鼠后肢运动神经功能评估：采用改良大鼠神经功能缺损评分表分别于大鼠手术前、手术后第1、2、3、4、5、6、7天进行评估，并记录；7)检测方法(1)HE染色：治疗1周后处死大鼠，取大鼠SCI部位组织，常规多聚甲醛固定、石蜡包埋切片，行HE染色，显微镜下观察脊髓神经细胞形态学变化；(2)普鲁士蓝染色：治疗1周后处死大鼠，取大鼠SCI部位组织，常规多聚甲醛固定、石蜡包埋切片，行HE染色，显微镜下观察脊髓神经细胞局部组织内各种出血性病变变化；(3)TUNEL染色：治疗1周后处死大鼠，取大鼠SCI部位组织，冰冻切片，行TUNEL染色，显微镜下观察脊髓神经细胞凋亡情况；(4)Western‑Blot检测：治疗1周后处死大鼠，取大鼠SCI部位组织，采用Western‑Blot检测凋亡蛋白的表达，观察脊髓神经细胞凋亡情况；(5)超氧化物歧化酶检测：采用SOD试剂盒，分别于大鼠手术前、手术后第1、3、5、7天收集大鼠血清，治疗1周后处死大鼠，取大鼠血清及SCI部位组织，进行SOD检测；(6)过氧化氢酶检测：采用CAT试剂盒，分别于大鼠手术前、手术后第1、3、5、7天收集大鼠血清，治疗1周后处死大鼠，取大鼠血清及SCI部位组织，进行CAT检测；(7)早期炎症因子检测：采用ELISA试剂盒，分别于大鼠手术前、手术后第1、3、5、7天收集大鼠血清，治疗1周后处死大鼠，取大鼠血清及SCI部位组织，进行TNF‑α检测；(8)晚期促炎细胞因子检测：采用ELISA试剂盒，分别于大鼠手术前、手术后第1、3、5、7天收集大鼠血清，治疗1周后处死大鼠，取大鼠血清及SCI部位组织，进行HMGB1检测；8)数据处理和统计学分析：采用IBM SPSS Statistics 19、SigmaPlot 12.5及Adobe IIIustrator CS5进行数据处理、统计学分析及图像处理，Western Blot实验结果采用单因素方差分析，计量资料采用均数±标准差表示；用时间和分组双因素方差分析，多组间两两比较采用SNK检验；神经功功能评分采用Kruskal‑Wallis检验，若存在组间差异，以Mann‑Whitney U检验Bonferroni进行两两比较；P＜0.05为差异有统计学意义；步骤2、临床实验部分1)纳入标准：选择急性SCI患者，根据ASIA损伤评分将其分为A、B、C、D、E级别，将符合B、C、D损伤级别的患者60例纳入实验组，并征得患者及家属同意，经连云港市东方医院伦理委员会批准；排除标准：严重的凝血功能障碍，危及生命的其他脏器损伤或多器官功能衰竭及出现下肢机械压缩，影响康复功能评定及康复治疗措施的实施者；2)分组：随机分成3组，即MP组n＝20、MP+H2全程治疗组n＝20、MP+H2二次损伤期治疗组n＝20；说明：MP组：甲强龙常规应用，即伤后8h内甲强龙首剂30mg/kg，15min内静脉快速滴注，余23h改为5.4mg/kg.h连续滴注；MP+H2全程治疗组：伤后8h内甲强龙首剂30mg/kg，15min内静脉快速滴注，同时即给予富氢生理盐水250ml治疗，余23h改为甲强龙5.4mg/kg.h连续滴，此后6天给予富氢生理盐水250ml静滴；MP+H2二次损伤期治疗组：伤后8h内甲强龙首剂30mg/kg，15min内静脉快速滴注，余23h改为5.4mg/kg.h连续滴注，而富氢生理盐水250ml在损伤后24小时以后给予；所有各组患者均治疗2周；3)早期治疗及康复治疗：所有各组患者SCI早期均接受减压、固定的手术治疗；损伤后2周均接受正规康复治疗；(1)运动训练：括正确体位的摆放，瘫痪肢体的被动运动，个人卫生护理；(2)物理因子：功能性电刺激，以精确的刺激顺序和刺激强度激活瘫痪或轻瘫的肌肉；(3)步行能力的训练：①用减重设备进行步态训练②机器人模式减重活动平板训练；(4)并发症的康复治疗：①神经源性膀胱：药物、间歇导尿、神经电刺激；②肌痉挛；持续牵张训练；巴氯芬：(5)矫形器及辅助用具的应用；(6)心理干预与家庭支持；4)评估手段：所有各组患者均随访6个月，分别于治疗前、治疗期间2周内每天、1月、3月、6月，评估改良Barthel指数MBI和ASIA评分；5)统计学分析：采用SPSS统计学软件包进行处理，数据以均数士标准差表示，组内和组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有显著性意义。