[发明专利]一种利用热带爪蟾胚胎测定水环境样品发育毒性的方法

摘要

本发明公开了一种利用热带爪蟾胚胎测定水环境样品发育毒性的方法，包括以下步骤：1)挑选性成熟热带爪蟾，待蛙抱对产卵结束后收集胚胎；2)将采集好的待测水环境样品按倍比稀释，作为暴露组；3)挑选NF8‑11阶段的胚胎，培养并记录孵化个数，将未孵化的胚胎挑出，48h统计死亡个数；4)将存活胚胎处理后固定于4％的甲醛溶液中，观察胚胎的发育状况，并拍照分析处理；5)进行数据的统计分析；6)对毒性进行分级为无毒、轻毒、中毒和重毒。本发明通对畸形类型进行统计，建立畸形表型识别图谱，确定对应的畸形程度分级，建立畸形表型统计表，并计算不同浓度水环境样品的总畸形分值。所建立的胚胎的畸形表型类型覆盖全面，数据易整理，结果直观。

主权项

1.一种利用热带爪蟾胚胎测定水环境样品发育毒性的方法,其特征在于，包括以下步骤：1)挑选性成熟热带爪蟾多对，采用人工注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)注射液100单位，置于黑暗安静的环境进行抱对产卵；成蛙每隔3个月有规律重复注射，常年循环使用；每只爪蟾都进行2次注射，待蛙抱对产卵结束后收集胚胎；2)将采集好的待测水环境样品标记好并在4℃下保存，分别取该样品按照100％、50％、25％、12.5％倍稀释，得到共4组待测试样品，分别作为暴露组，另外再设置一个对照组；3)挑选NF8‑11阶段的胚胎，4个暴露组和1个对照组各组均设4个平行，每个90mm的培养皿中20个胚胎，加入40ml培养液，放在生化培养箱中培养；温度26±0.5℃，光周期12小时白天12小时黑，24h换液，记录孵化个数，并将未孵化的胚胎挑出，48h统计死亡个数；暴露2天后用4％的甲醛固定；4)将存活胚胎用100mg/L MS‑222麻醉处理后固定于4％的甲醛溶液中，取出经固定的胚胎，在Nikon解剖镜下观察胚胎的发育状况，用Nikon DS‑SM型显微照相系统进行拍照，图像用Photoshop7.0分析处理，在光学显微镜下观察，用显微照相系统照相；相关指标有：孵化率、死亡率、畸形率、体长，判断畸形类型；5)用SPSS16.0进行数据的统计分析；以每盘中的胚胎为一个平行样，数据以平均值±标准差(S.D.)表示，n＝4；用Tukey‑test进行分析；对水环境样品的评价主要采用四项指标：死亡率、畸形率、生长抑制率和畸形表型值；6)通过统计分析显示，若暴露组的胚胎各评价指标明显高于或低于对照组，则说明被检测的水环境样品有发育毒性；同时，根据胚胎畸形表型对正常、轻微、中等和严重组进行赋分值0、1、2和3分，分值越大，危害程度越大，毒性越强，并根据分值对毒性进行分级为无毒、轻度毒性、中度毒性和重度毒性；所述人绒毛膜促性腺激素(HCG)注射液的配制方法：用10cc的注射器注射5.0ml 0.9％的盐水溶液到5000单位的HCG药瓶中，摇动直到全部溶解，配制成人体绒毛膜促性腺激素(HCG)储备液1000单位/ml；用1.0cc的注射器加0.15ml HCG储备液到0.85ml 0.9％的盐水溶液，摇动直到全部混合，配制成HCG注射液150单位/ml，HCG注射液被用来进行人工诱导性成熟和抱对；所述畸形表型值是于畸形表型进行赋值得到的，畸形类型主要包括：头部变小、眼睛变小、眼睛变大、眼睛有异物、唾液腺位移、围心腔水肿、躯干增大、皮肤色素减少、泄殖腔水肿、泄殖腔后移、鳍变窄、尾巴弯曲、脊柱弯曲。