[发明专利]一种基于大肠杆菌表达系统的重组pBpp蛋白制备方法

摘要

本发明提供了一种基于大肠杆菌表达系统的重组pBpp蛋白制备方法，该技术方案以斑马鱼粪便菌群DNA为模板，扩增得到pBpp表达基因，再利用pET28c质粒为载体，先于大肠杆菌TOP10中扩增质粒，而后转化入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达。在此基础上，本发明针对重组菌株的特性设计了适宜的蛋白表达及诱导条件，对于胞内表达的pBpp蛋白，本发明对菌体进行超声破碎后，先利用镍珠结合游离的蛋白，再进行蛋白洗脱，最后分别利用PBS和甘油进行透析，从而实现了pBpp蛋白的有效纯化。实验发现，本发明所制备的pBpp蛋白可确切诱导胰腺中β细胞的增殖，从而对因胰岛β细胞损伤所导致的糖尿病起到治疗效果。

主权项

一种基于大肠杆菌表达系统的重组pBpp蛋白制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)以斑马鱼粪便菌群的总DNA为模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分别为上、下游引物执行PCR扩增，得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段，即为pBpp蛋白表达基因；2)取步骤1)所获得的pBpp蛋白表达基因，先经NcoI和XhoI双酶切，酶切产物纯化后采用T4连接酶连接到pET28c上，即得到重组质粒pET28c‑pBpp；3)取步骤2)所得的重组质粒pET28c‑pBpp，转入大肠杆菌E.coli Top10中，得到重组菌株；4)培养步骤3)所得的重组菌株，从中提取重组质粒pET28c‑pBpp，将其转化入大肠杆菌E.coli BL21，即得到重组表达菌株pET28c‑pBpp‑BL21；5)利用含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基培养步骤4)所得的重组表达菌株pET28c‑pBpp‑BL21，收集菌体；6)利用EQ Buffer重悬步骤5)所得菌体，超声破碎，而后以10000rpm的转速离心10min，取上清；取镍珠，悬浮于EQ Buffer中，以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，悬浮于EQ Buffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于EQ Buffer中，得到镍珠悬液，将其加入至所述上清中，于4℃条件下保持2h，而后以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，悬浮于Wash Buffer中，而后在旋转混匀仪上常温旋转10min，而后以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于EQ Buffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀，重悬于EQ Buffer中，再以4000rpm的转速离心15min，收集沉淀；7)取步骤6)所得沉淀物悬浮于洗脱Buffer中，在旋转混匀仪上常温旋转15min，以4000rpm的转速离心15min，收集上清，再以4000rpm的转速离心15min收集上清；8)取步骤7)所得的上清液，以13000rpm的转速离心30～60min，取上清装入透析袋，先利用1×PBS缓冲液透析3h，再用25％体积浓度的甘油水溶液透析3h，即得到所述pBpp蛋白。