[发明专利]敲除衣藻内源基因和表达外源基因的载体构建方法及应用

摘要

本发明提出了一种敲除衣藻内源基因和表达外源基因的载体构建方法及应用，该载体包含一个潮霉素抗性标记基因，标记基因两端都有一个来自RubisCO基因的splicing donor序列(TCCATTTGCAG/GATGTTCGA)，三个串联重复的终止密码子，以及一个转录终止子。该载体用Spel Ⅰ和Cla Ⅰ双酶切后产生的1.9kb片段电击转化莱茵衣藻细胞，即使载体插入衣藻基因内含子中插入载体也成为mRNA一部分，基因转录在三个串联重复终止密码子和转录终止子处停止。与没有SIS的2.6kb AphVⅢ插入载体相比，新构建的载体提高了突变体转录终止效率。

主权项

1.一种敲除衣藻内源基因和表达外源基因的载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS11、AphVⅡ基因克隆：从质粒pHyg3中克隆，有效片段包括β2-Tublin启动子，rbcS23′UTR，rbcS2基因的第一个内含子rbcS2intron1，AphVⅡ基因，其中rbcS2intron1位于AphVⅡ基因中；/nS12、splicingdonor的合成：包括正向splicingdonor FSD和反向splicing donorRSD；FSD由F-Spe-F，F-Spe-R，F-Hind-F，F-Hind-R四个引物退火合成，RSD由R-Nco-F，R-Nco-R，R-Cla-F，R-Cla-R四个引物退火合成；/n引物的序列为：/nF-Spe-F：/n5’-CTAGTTCCATTTGCAGGATGTTCGATAATTAGCTGATAAAAAGCGGAGGAGTTTTGCAA-3’/nF-Spe-R：/n5’-CGCTTTTTATCAGCTAATTATCGAACATCCTGCAAATGGAA-3’/nF-Hind-F：/n5’-TTTTGTTGGTTGTAACGATCTGTCGCCAACGGTGAGCTTGA-3’/nF-Hind-R：/n5’-AGCTTCAAGCTCACCGTTGGCGACAGATCGTTACAACCAACAAAATTGCAAAACTCCTC-3’/nR-Nco-F：/n5’-TTTGTTGGTTGTAACGATCTGTCGCCAACGGTGAGCTTGC-3’/nR-Nco-R：/n5’-CATGGCAAGCTCACCGTTGGCGACAGATCGTTACAACCAACAAAATTGCAAAACTCCTC-3’/nR-Cla-F：/n5’-CGATTCCATTTGCAGGATGTTCGATAATTAGCTGATAAAAAGCGGAGGAGTTTTGCAAT-3’/nR-Cla-R：/n5’-CGCTTTTTATCAGCTAATTATCGAACATCCTGCAAATGGAAT-3’/n每四个引物在一个反应体系中进行，反应体系包括：四个引物浓度为10μM，各1μl；TakaraLATaq，0.2μl；10xLAPCRbuffer，2μl；ddH₂O，13.8μl；退火程序如下：94℃5min，90℃5min，80℃10min，70℃10min，60℃10min，50℃10min，40℃10min，30℃10min；合成的双链DNA片段用2％的琼脂糖凝胶电泳分离，天根纯化试剂盒纯化，纯化后的FSD和RSD序列分别用SpeI/HindIII，NcoI/ClaI酶切；/nS13、酶切后的FSD：RSD片段连接到AphVII的5′，3′端形成FSD::AphVII::RSD大片段，经1％琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，天根试剂盒纯化回收；/nS14、pHK415载体的构建：pBluescriptIIKS质粒用SpeI/ClaI双酶切，FSD::AphVII::RSD片段连接到酶切后的pBluescriptIIKS上形成pHK415质粒载体；/nS15、pHK415载体验证：pHK415质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，提取阳性质粒，用SpeI/ClaI双酶切，经经1％琼脂糖凝胶电泳分离1.9kb目的片段，天根试剂盒纯化回收后测序验证。/n