[发明专利]一种缺失ompA基因鸭疫里默氏杆菌CH3减毒菌株的构建方法

摘要

本发明公开了一种缺失ompA基因鸭疫里默氏杆菌CH3减毒菌株的构建方法，具体步骤为：培养鸭疫里默氏杆菌CH3株及提基因组；Riemerella anatipestifer CH3株ompA基因同源臂及抗性spec基因片段的克隆；重组质粒pT‑ompA‑LSR的构建；自杀性重组质粒pDS‑ompA‑LSR的构建；将自杀质粒pDS‑ompA‑LSR转到BW19851大肠杆菌中。本发明对鸭疫里默氏杆菌RA的分子致病机制十分有意义，也对今后的育苗的研发奠定了基础。

主权项

1.一种缺失ompA基因鸭疫里默氏杆菌CH3减毒菌株的构建方法，具体步骤为：（1）、培养鸭疫里默氏杆菌CH3株及提基因组：制备基因组模板：从‑80℃冰箱取冻存的RA CH3株，在TSA平板复苏，在5%CO2，37 ℃恒温培养箱培养16h，将挑菌种转接至4ml TSB液体培养基中后，放置37 ℃，5% CO2恒温培养箱静置培养1‑4小时后，放37 ℃震荡培养箱培养10h，后离心收集菌体，根据基因组试剂盒中的说明书的操作步骤制备CH3株的基因组；（2）、Riemerella anatipestifer CH3株ompA基因同源臂及抗性spec基因片段的克隆：a:以RA CH3基因组为模板，以ompA‑L F/ompA‑L R 以及ompA‑R F/ompA‑R R为引物PCR分别扩增ompA基因的左右侧片段作为同源重组的同源臂，将目的片段连接pGEM‑Teasy载体中转化到E.coli DH5α感受态细胞，酶切鉴定阳性质粒，命名pT‑ompA‑L、pT‑ompA‑R并进行测序；b:壮观霉素抗性基因（Spc）的扩增：有合适的抗性标记，突变株才可以筛选,在G‑菌中壮观霉素抗性基因可以正常表达，并且RA对Spc抗性敏感,用上海兽医研究所胡青海实验室保存的pFW5质粒为模板，用引物spec F /R扩增Spc基因表达盒，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，胶回目的片段连接到pGEM‑T‑easy载体上，转化到E.coli DH5α感受态细胞，酶切鉴定阳性质粒，命名pT‑Spc并进行测序；（3）、重组质粒pT‑ompA‑LSR的构建：提取重组质粒pT‑ompA‑L、pT‑ompA‑R、pT‑Spc，对pT‑ompA‑L重组质粒用BamHI和MscI双酶切，对pT‑ompA‑R重组质粒用SphI和XhoI进行双酶切，对pT‑Spc重组质粒用MscI和XhoI进行双酶切，37℃水浴，2.5h后，用琼脂糖凝胶电泳分离，将目的片段切下，用胶回收试剂盒纯化，酶切反应体系如下：双酶切体系：          BamHI                   1ulMscI                 1ul                     CutSmart buffer         5ul                     pT‑ompA‑L质粒           15ul                     ddH2O                   28ul                                             50ul双酶切体系：          XhoI                    1ul                     MscI                    1ul                     CutSmart buffer         5ul                     pT‑Spc质粒              15ul                     ddH2O                   28ul                                             50ul双酶切体系：          XhoI                    1ul                     SphI                    1ul                     CutSmart buffer         5ul                     pT‑ompA‑R质粒           15ul                     ddH2O                   28ul                                             50ul将pT‑ompA‑L、pT‑ompA‑R、pT‑Spc的双酶切产物，琼脂糖凝胶电泳检测，对其中ompA‑L约882bp、ompA‑R约795bp和Spc约1119bp条带进行凝胶回收，将上述三种胶回收产物4℃连接过夜，15ul反应体系如下：10×buffer           1.5ulompA‑L               4ulSpc                  4.5ulompA‑R               4ulT4 DNA ligase酶      1ul                     15ul以上述连接产物作为模板，用ompA‑R R和ompA‑L F作为引物，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳鉴定回收目的片段大小约2800bp的DNA片段，目的片段连接pGEM‑Teasy载体，转化到E.coli DH5α感受态细胞中，酶切鉴定为阳性的重组质粒，命名为pT‑ompA‑LSR并测序；（4）、自杀性重组质粒pDS‑ompA‑LSR的构建：pT‑ompA‑LSR质粒通过小提试剂盒制备，pDS132质粒通过小提中量试剂盒制备，用SphI和BamHI两个酶对pDS132质粒进行双酶切，37℃，酶切2.5h，酶切体系反应如下：双酶切体系：          BamHI                   1ul                     SphI                    1ul                     CutSmart buffer         5ul                     pDS132                  15ul                     ddH2O                   28ul                                             50ul对pT‑ompA‑LSR用ScaI单酶切，37℃，酶切2.5h，后加NaCN 4ul，100ul无水乙醇，放‑80℃低温冰箱过夜，第二天取出12000r/min离心10min，去上清，后在用75%的乙醇，重悬，12000r/min离心10min，去上清重复两次，将离心管风干后用SphI和BamHI双酶切，37℃，酶切2.5h，分部酶切体系反应如下：单酶切体系：          ScaI                    1ul                     CutSmart buffer         5ul                     pT‑ompA‑LSR             15ul                     ddH2O                   29ul                                             50ul再双酶切体系：        BamHI                   1ul                     SphI                    1ul                     CutSmart buffer         5ul                     ddH2O                   43ul                                             50ul将pDS132双酶切产物6000bp条带回收，pT‑ompA‑LSR三酶切产物2800bp条带回收，将两种胶回收产物4℃连接过夜，10ul反应体系如下：10×T4 DNA ligasebuffer                      1ulompA‑LSR DNA片段                             4ulpDS132 载体                                  4ulT4 DNA ligase酶                              1ul                                             10ul将连接产物转化到E.coli BW19851感受态细胞中，通过含有100ug/ml的氨苄青霉素的LB平板筛选重组质粒，挑单菌落到LB液体培养基中含有同种抗性，37℃振荡培养6h，通过酶切鉴定阳性的重组质粒；（5）、将自杀质粒pDS‑ompA‑LSR转到BW19851大肠杆菌中：将自杀质粒pDS‑ompA‑LSR转化到E.coli BW19851感受态细胞中，通过含有100ug/ml的氨苄青霉素的LB平板筛选重组质粒，挑单菌落到LB液体培养基中含有同种抗性，37℃振荡培养6h，通过酶切鉴定阳性的重组质粒；（6）、将（5）中含有自杀质粒的BW19851大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌CH3用双亲本滤膜结合转导的方法结合，使同源臂导入鸭疫里默氏杆菌CH3的基因组中，通过同源臂交换和壮观霉素抗性基因筛选得到阳性克隆；c、取新鲜大肠杆菌 BW19851‑pDS132‑OmpA‑LSR 和鸭疫里默氏杆菌 CH3，分别在含100μg/mL Amp的 LB 固体培养基上和 TSA 固体培养基上划线，37℃培养至对数生长中期；d、用浓度为 10mmol/L 的 MgSO4 溶液 5ml 将两种细菌从平板上洗下来，收集1ml菌体到1.5ml 离心管内，4℃ 5000rpm，离心 5min，再用 1ml 浓度为 10mmol/L 的 MgSO4 洗 2 次，用 1ml 浓度为10mmol/L 的 MgSO4 重悬；e、按照供体菌 BW19851‑pDS132‑OmpA‑LSR 与受体菌 CH3，按浓度比 1：2 的比例混匀，BW19851‑pDS132‑ TonB1‑LSR 菌数为 2×108CFU，鸭疫里默氏杆菌 CH3 菌数为 4×108 CFU，用无菌 0.22μm 微孔混合纤维滤膜上过滤；f、用无菌镊子夹取滤膜置于 TSA 固体培养基上，30℃ 5% CO2培养 8h；g、取出滤膜，用 5mL 浓度为 10mmol/L 的 MgSO4 溶液将滤膜上的细菌洗脱下来，取 50‑100μL 涂布于含壮观霉素（80μg/mL）和卡那霉素（50 μg/mL)的 TSA 固体培养基上，37℃ CO2培养箱内，培养 24h 以上至长出单菌落，h、挑取单菌落至含壮观霉素和卡那霉素的 TSB 液体培养基中培养； Riemerella anatipestifer CH3株基因缺失株CH3△OmpA的筛选与鉴定：挑取在Spc和Kan抗性选择平板上生长的细菌克隆为候选突变株，做进一步的PCR鉴定和Western blot 分析：PCR鉴定：挑取可能的重组子克隆增殖，用PCR分别扩增壮观霉素抗性基因Spec、鸭疫里默氏杆菌的16 S rRNA基因和ompA基因ORF，基因型为16 S rRNA+Spec+OmpA‑的接合子克隆为OmpA依赖外膜蛋白受体ompA基因的缺失株，命名为CH3△OmpA，Western blot 分析：将 CH3 野生株，转接于 TSB 培养基，CH3△OmpA株，转接于卡那霉素50ug/mL和壮观霉素80ug/mL的TSB培养基； cCH3△OmpA株转接于，卡那霉素50ug/mL，壮观霉素80ug/mL和头孢西丁1ug/mL的TSB培养基中， 37℃过夜培养，12000rpm 离心 5min，弃上清，沉淀用 PBS 洗 3 次，最后用适量 PBS 悬浮后与等量 2×buffer 混合后煮沸 10min，以 5ug 的蛋白量作 SDS‑PAGE 电泳，将电泳后的凝胶取出，电转印 1h，转印好的纤维素膜置于 PBST中漂洗 3 次，每次 3‑5 min，将膜置于含 10%脱脂乳的 PBST 中 4℃封闭过夜，PBST漂洗 3 次， 每次 15 min，加入 1：200 稀释的 1 型 WJ4 OmpA 阳性血清，作用1h，再以 PBST 漂洗 3 次,每次15min，加入辣根过氧化物酶标羊抗鼠二抗进行稀释，作用1h，以 PBST 漂洗 3 次,每次15min后用ECL 显色，即可。