[发明专利]一种针对ctDNA低频检测的文库构建方法

摘要

本发明涉及低频检测的文库技术领域，尤其是一种针对ctDNA低频检测的文库构建方法，包括如下步骤：DNA的修饰修复处理，DNA末端的处理，DNA测序接头的连接处理过程，DNA测序文库的修饰、扩增等处理，一次重复DNA测序文库的修饰、扩增等处理，再一次重复得出成品，具有优良稳定性、显著提高文库测序接头连接效率、大幅提高文库产量或目的片段回收效率、提高文库质量的能满足ctDNA低频检测的文库构建方法，与现有技术相比，具有较大的优点和积极效果，比较节能、环保、节约成本、提高了效率且结构更加简单、易于制造使用。

主权项

1.一种针对ctDNA低频检测的文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤:第一步、DNA的修饰修复处理，借助各种DNA修复酶、修饰酶、聚合酶等工具酶处理DNA分子，不限于DNA去磷酸化、切除、添加、置换等功能，本步骤可以去除、修复DNA分子中存在一些错误碱基、突变碱基、损伤碱基、异常DNA双链结构、损伤化学基团等错误信息，提高后续DNA分子与测序接头的连接效率，然后配制反应预混液，10x Reaction buffer I 4 uL、去磷酸化酶，1U 1uL、UDG， 5U 1uL、Fpg， 10U 1uL、Water 13 uL，再加入15‑25 uL cfDNA底物（10ng），充分混匀后，放置在30‑40度温度下孵育8‑12分钟，然后60‑80度温度下处理8‑12分钟；第二步、DNA末端的处理，借助DNA修复酶、修饰酶、聚合酶等工具酶处理DNA分子末端，不限于DNA的去磷酸化、磷酸化、切除、添加等功能，本步骤构建DNA分子末端连接结构，为下一步测序接头连接做准备，向第一步反应产物中，加入以下工具酶预混液：10x Reaction buffer II 1uL、Water 6uL、T4 DNA聚合酶，5U 1uL、T4 PNK， 10U 1uL、Exo III， 10U 1uL，放置在15‑25度温度下孵育18‑25分钟，然后65‑80度温度下处理8‑12分钟；第三步、DNA测序接头的连接处理过程，借助DNA修复酶、修饰酶、聚合酶等工具酶处理DNA分子末端，实现DNA测序接头与DNA分子的连接，此外，DNA测序接头含有7‑12个随机核糖核酸分子组成的分子标签，能够实现每个DNA片段的末端拥有唯一组合的分子标签，向第二步反应产物中，依次加入以下组分：10x Reaction buffer III 3 uL、ATP， 100mM 0.8 uL、T4 DNA ligase， 400U 5 uL、Water 16 uL、DNA adapter， 20uM 5 uL，放置在20‑30度温度下孵育12‑18分钟；第四步、DNA测序文库的修饰、扩增等处理，向第三步反应产物中加入20uL水补足至100uL，吸取 100μL (1.0×) AMPure XP 磁珠至上述反应管中，用移液器轻轻吹打5‑15次，充分混匀，室温孵育3‑8min，将反应管瞬时离心后， 置于磁力架上静置2分钟进行磁珠的分离，保持反应管始终置于磁力架上， 加入 200 μL 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育20‑40秒，小心移除上清；第五步、再重复第四步，将反应管瞬时离心，并用移液器再次吸尽残留液体，打开反应管盖并保持反应管始终置于磁力架中，将反应管从磁力架中取出，加入 20 μL 灭菌超纯水洗脱 DNA，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管瞬时离心并置于磁力架中，待溶液澄清后， 小心吸取20μL上清至新的灭菌PCR管中，准备如下反应预混液：2x PCR Master Mix 25 uL、Primer P5， 10uM 1.5 uL、Primer P7， 10uM 1.5 uL、Water 2 uL，将反应管从磁力架中取出，加入 20 μL 灭菌超纯水洗脱 DNA，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管瞬时离心并置于磁力架中，待溶液澄清后， 小心吸取20μL上清至新的灭菌PCR管中；吸取 50μL (1.0×) AMPure XP 磁珠至上述反应管中，用移液器轻轻吹打8‑12 次，充分混匀，室温孵育3‑8min，将反应管瞬时离心后， 置于磁力架上静置2分钟进行磁珠的分离，待溶液澄清后，小心移除上清，避免接触并吸取磁珠，切记勿弃除磁珠，保持反应管始终置于磁力架上， 加入 200 μL 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育20‑40秒，小心移除上清；第六步、再重复第五步，将反应管瞬时离心，并用移液器再次吸尽残留液体，打开反应管盖并保持反应管始终置于磁力架中，将反应管从磁力架中取出，加入 20 μL 灭菌超纯水洗脱 DNA，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管瞬时离心并置于磁力架中，待溶液澄清后， 小心吸取20μL上清至新的灭菌PCR管中。