[发明专利]一种应用CD45免疫荧光联合CEP 8探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用

摘要

本发明属于生物医学临床检测领域，具体涉及一种应用CD45免疫荧光联合CEP 8荧光原位杂交探针一步法共染鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用。所述试剂盒包括：固定液、2×SSC、0.3％NP‑40/0.4×SSC、0.075M KCl溶液、CD45单抗和CEP 8探针混合液、DAPI复染剂、穿孔剂、封闭液和封片剂。本发明采用CD45免疫荧光抗体联合CEP 8荧光原位杂交探针鉴定捕获的循环肿瘤细胞，通过一步法完成了免疫荧光和荧光原位杂交检测，克服了免疫荧光检测和荧光原位杂交检测联合使用时存在相互干扰、检测耗时较长的问题，一步法杂交孵育在2h内快速完成，大大减少了检测时间，并且检测结果观察直观。

主权项

1.一种应用CD45免疫荧光联合CEP8荧光原位杂交探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒检测鉴定循环肿瘤细胞的方法，所述方法用于非疾病诊断和治疗目的，其特征在于，具体地包括如下步骤：（1）收获细胞：将捕获的循环肿瘤细胞样本（CTCs）吸至尖底离心管，离心、去上清；（2）低渗：加入预温至37℃的0.075mol/L KCl 溶液6~8mL，用吸管吹打混匀后置37℃恒温箱20~30min；（3）预固定：加入固定液2mL，吹打混匀，离心；（4）吸去上清液，加新鲜配制的固定液5mL，吹打混匀，固定10min，离心；（5）重复步骤（4）直至细胞沉淀洗白洗干净；（6）细胞悬液的制备：吸去上清液，加入适量固定液，制成浓度合适的细胞悬液；（7）制片：吸取3~5μL细胞悬液滴至防脱载玻片上，56℃老化0.5~2小时；（8）封闭：向玻片加入100uL封闭液，室温封闭10min后，2×SSC漂洗5min；（9）穿孔：滴加100ul穿孔剂，室温封闭10min后，2×SSC漂洗5min；（10）脱水：将玻片依次置于70%、85%和100%乙醇溶液中各2min脱水后自然干燥玻片；（11）杂交孵育：取出CD45单抗和CEP 8探针混合液，室温静置5分钟，彻底混匀后短暂离心，取10μL滴于细胞滴片杂交区域，立即盖上22mm×22mm的盖玻片，探针在盖玻片下应均匀展开无气泡，用树脂封边，将玻片置于杂交仪上进行杂交孵育；所述杂交孵育的条件为：75℃变性2分钟，37℃孵育2小时；（12）洗涤：取出孵育后的玻片，去除盖玻片上的橡皮胶，立即将玻片置于65℃~68℃ 0.3%NP‑40/0.4×SSC溶液中，振荡10~20s脱去盖玻片，浸泡5~10分钟，将玻片置于37℃去离子水中，振荡1~3s，浸泡2分钟，暗处自然干燥玻片；（13）封片：滴加10uL DAPI复染剂；（14）阅片：在荧光显微镜下选用合适的滤光片观察玻片；（15）结果判定：a. CD45染色阳性为白细胞；b. CD45未被染色，但呈巨大裸核，为非肿瘤细胞；c. CD45未被染色，信号点≥2个，非巨大裸核可以判断为循环肿瘤细胞；所述试剂盒包括：固定液、2×SSC、0.3%NP‑40/0.4×SSC、0.075M KCl溶液、CD45单抗和CEP8探针混合液、DAPI复染剂、穿孔剂、封闭液和封片剂；所述CD45单抗和CEP8探针混合液的组分为荧光标记CD45单抗、CEP 8荧光原位杂交探针、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、BSA、SSC和Triton X‑100；所述CD45单抗和CEP8探针混合液各组分的浓度为：荧光标记CD45单抗的浓度为0.002mg/ml，CEP8荧光原位杂交探针的浓度为2ng/µL，硫酸葡聚糖10%、去离子甲酰胺50%、BSA1%、6×SSC、Triton X‑100 1‰；所述固定液为甲醇和冰乙酸按体积比3:1混合所得混合液；所述穿孔剂的组分为5‰Triton X‑100、0.1M磷酸盐缓冲液；所述封闭液为5%的BSA；所述封片剂为树脂。