[发明专利]一种DsRED2报告基因在棉花遗传改良中的应用

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及具体涉及一种DsRED2报告基因在棉花遗传改良中的应用。所述的DsRED2可作为报告基因对转基因材料进行筛选，由于红色荧光蛋白可视性强，可以直接根据肉眼观察筛选转基因材料。显微观察时DsRED2报告基因可以避免棉花组织器官的自发荧光和叶绿素自发荧光干扰。DsRED2报告基因在不同遗传背景下可以稳定表达，DsRED2基因也可以应用于棉花杂交种的识别，以DsRED2转基因棉花株系材料作为父本以其它棉花品种作为母本生产杂交种时，在母本棉花植株上收获的红色种子即为杂交种子，利用本发明可以快速识别杂交种。

主权项

1.一种报告基因DsRED2在棉花遗传改良中的应用，其特征在于，包括遗传转化、转基因后代阳性鉴定、转基因后代表达量的检测和杂交种识别，所述的应用步骤如下所述：：(1)将含有红色荧光蛋白DsRED2基因的载体pCAMBIA2300导入到农杆菌菌株EHA105；(2)挑选饱满、健康的棉花种子剥去种皮后，用0.1％的HgCl2浸泡8‑12min，再用无菌水清洗3‑4次，将灭菌后的无菌外植体棉花种仁接种于无菌苗培养基中，一天后扶苗，去种皮，5天后得到无菌苗下胚轴；(3)取无菌苗下胚轴，用解剖刀切成0.5‑0.8cm小段接种于农杆菌活化培养基悬浮的农杆菌菌液中，侵染5mim后，将外植体转移到无菌滤纸上吸干残留菌液并吹10min使表面稍微干燥；(4)将无菌苗下胚轴接种在含有共培培养基的培养皿中，于21℃下共培养48h，将无菌苗下胚轴转移到到选择培养基中，每一个月继代培养一次直到获得胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织转入分化培养基，通过培养获得胚状体；(5)将根生长受到抑制的再生幼苗转移至生根培养基上，促进生根；(6)对转基因后代进行阳性鉴定，鉴定用的引物序列如下：DsRED‑F:5’‑ACAGAACTCGCCGTAAAGAC‑3’，DsRED‑R:5’‑CCGTCCTCGAAGTTCATCAC‑3’；(7)提取转基因植株总RNA并反转录，以cDNA为模板通过荧光定量PCR对目的基因的表达量进行检测，扩增用的引物序列如下：Q‑RT‑DsRED‑F：5'‑CTCCGAGAACGTCATCACCG‑3'，Q‑RT‑DsRED‑R：5'‑TGGAGCCGTACTGGAACTGG‑3'；(8)以DsRED2转基因棉花株系材料作父本，以其它棉花品种作为母本进行杂交，在母本棉花植株上收获的红色种子即为杂交种子；上述步骤(1)至(5)中培养基的配制：无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，附加15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel；愈伤组织诱导培养基：MSB，附加24‑D 0.1mg/L，KT 0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel；农杆菌活化培养基：胰化蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4.7H2O 0.1g/L，KH2PO4 0.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.0g/L，pH5.8；共培养培养基：MSB，附加24‑D 0.1mg/l，KT 0.1mg/l，50mg/l AS，3％Glucose，0.25％Phytagel，pH5.85‑5.95；选择培养基：MSB，附加2，4‑D 0.1mg/L，KT 0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel，卡那霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，pH 5.85‑5.95；分化培养基：去掉NH4NO3、并将KNO3加倍的MSB，附加IBA 0.5mg/L，KT 0.15mg/L，3％Glucose，Gln 1.0g/L，Asn 0.5g/L，0.25％Phytagel，pH 5.85‑5.95；生根培养基：1/2MSB，附加Gln 0.5g/L，Asn 0.25g/L，1.5％Glucose，0.25％Phytagel,pH 6.1；MSB的成分：MS培养基+B5维生素；所述的红色荧光蛋白DsRED2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。