[发明专利]一种自体脂肪间充质干细胞定向分化为黑色素细胞的方法

摘要

本发明公开了一种自体脂肪间充质干细胞定向分化为黑色素细胞的方法，具体步骤为黑色素细胞条件培养基制备；脂肪间充质干细胞的制备；黑色素细胞定向分化，所述的人表皮黑色素细胞株和黑素细胞完全培养基均购自上海拜沃生物公司，所述的脂肪组织的体积为20cm3，所述的DMEM培养基中含10%（v/v）FBS和40U/ml硫酸庆大霉素。本发明具有分化效率高、易于取得等优点。

主权项

一种自体脂肪间充质干细胞定向分化为黑色素细胞的方法，其特征在于：具体步骤为：一、黑色素细胞条件培养基制备：（1）、取第五代人表皮黑色素细胞株接种于含有30ml黑素细胞完全培养基的T75细胞培养瓶，接种密度为5×103/ml；（2）、观察细胞生长状态，进入快速生长期后，予以低剂量窄谱紫外线照射（NB‑UVB）,强度为0.5J/cm2，时间为26‑34 s；（3）、24h后收集上清，离心5min；（4）、将上清用0.22μm孔径滤膜过滤除菌，即制得黑素细胞条件培养基，4℃避光保存，备用；二、脂肪间充质干细胞的制备：（5）、通过外科方式获得脂肪组织；（6）、用外科手术剪把脂肪组织剪碎成1mm3的小块；（7）、用含有0.01%（m/v）Ⅰ型胶原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖DMEM培养基10ml，在37℃的条件下，消化55‑65min；（8）、吹打上述细胞悬液4‑5次，在室温条件下，以 860×g的转速，离心10min；（9）、吸弃上层悬浮脂肪颗粒和成熟脂肪细胞，获取底部细胞团，采用PBS溶液重悬细胞，并用100μm孔径滤膜过滤；（10）、对细胞滤液计数，加入过量的1×BD IMag™ Buffer，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清；（11）、把CD31磁珠彻底涡旋均匀，然后每1×107个细胞加50μL CD31磁珠，混合均匀后，在30℃的条件下孵育25‑35min；（12）、用BD IMag™ Buffer把体系调整到 1‑8×107个/ml细胞之后，迅速把标记好的体系放到磁力架上孵育8‑10分钟；（13）、吸出磁力架上的流式管里面的液体上清，上清细胞为CD31‑细胞，此时即为去除了内皮细胞后，纯化的脂肪干细胞；（14）、在1500rpm条件下，将上清液离心2‑8min，弃上清；（15）、将上述细胞置于37℃，5% CO2培养箱中，用10ml DMEM培养基进行培养，每周换液2次；（16）、细胞融合度达到80%以上后，吸干培养液，加入PBS液，在1500rpm条件下离心2‑8min，弃上清，再加入PBS液，在1500rpm条件下离心2‑8min，弃上清；（17）、向培养瓶内加入胰蛋白酶‑ EDTA 溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的CO2温箱2‑3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml高糖DMEM培养基终止消化；（18）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm条件下，离心7min，采用高糖DMEM培养基洗3次；（19）、将细胞按1:3比例分瓶传代，并用含有10%（v/v）FBS，40U/ml硫酸庆大霉素的 DMEM培养基进行培养；三、黑色素细胞定向分化（20）、第4代脂肪间充质干细胞，以5×104/ml密度接种于T75细胞培养瓶；（21）、细胞生长至80%融合度后，吸干细胞培养液，加入等体积的黑素细胞诱导培养基置于37℃，5%的CO2温箱进行培养；（22）、细胞生长至90%融合度时，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞，向培养瓶内加入胰蛋白酶‑ EDTA 溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的CO2温箱2‑3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml黑色素细胞诱导培养基培养基终止消化；（23）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm条件下，离心7min，采用黑色素细胞诱导培养基洗3次；（24）、将细胞按1:3比例分瓶传代，并用黑色素细胞诱导培养继续培养；（25）、培养至第6周，予以低剂量NB‑UVB照射，强度为0.5J/cm2，时间为30s，每周一次，至第10周为止，即可。