[发明专利]一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法，具体步骤为全细胞肿瘤抗原制备得到细胞悬液；将细胞悬液置于恒温水浴锅中；水浴锅中取出细胞悬液，放到‑75‑‑85℃超低温冰箱中，1h之后，转入37℃水浴锅中，轻轻摇晃，至完全融化，再次放入超低温冰箱中，如此反复3次；在12000rpm的条件下，离心10min；得到热休克肿瘤细胞冻融抗原；DC细胞制备；DC瘤苗制备。本发明具有免疫效果好、无副作用等优点。

主权项

一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法，其特征在于：具体步骤为：(一)、全细胞肿瘤抗原制备：(1)、分别取对数生长期的小细胞肺癌细胞系H520和H522各2×106个，悬浮于1ml PBS中，得到细胞悬液；(2)、将细胞悬液置于40‑43℃恒温水浴锅中，处理1h；(3)、水浴锅中取出细胞悬液，立即放到‑75‑‑85℃超低温冰箱中，1h之后，转入37℃水浴锅中，轻轻摇晃，至完全融化，再次放入‑75‑‑85℃超低温冰箱中，如此反复3次；(4)、在12000rpm的条件下，离心10min；(5)、取上清，即为热休克肿瘤细胞冻融抗原，并用0.2μm孔径过滤器过滤上清液，去除杂质后，将上清液置于‑75‑‑85℃超低温冰箱中保存备用；(二)、DC细胞制备：(6)、取自体外周血100ml于血袋中，在无菌条件下分装于含有15ml淋巴细胞分离液的离心管中，每管15ml，在2000rpm的条件下，离心15‑25min；(7)、离心结束后，吸取黄色透明层上的白膜层，再用生理盐水重悬于50ml离心管中，离心3‑8min，弃上清，如此反复两次；(8)、将细胞重悬于10ml的GT‑T551培养基中，然后装于T75培养瓶中，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中孵育2h；(9)、吸弃悬浮液，DC细胞贴壁，再加入40ml GT‑T551培养基培养，隔天换一次培养液；(三)、DC瘤苗制备：(10)、DC细胞培养第6天，将冻融抗原加入DC细胞中孵育4h；(11)、加入Poly(I:C)25μg/ml孵育20小时，诱导DC细胞成熟；(12)、在上述细胞液中加入LPS，使浓度为1μg/ml，孵育24h，以增强DC细胞表达共刺激分子，分泌IL‑12p70；(13)、第8天，细胞刮子从培养瓶底部刮起肿瘤细胞，收集到50ml离心管中，2000rpm，5min离心；(14)、弃上清，并重悬上述DC细胞于生理盐水中，离心3‑8min，弃上清，重复两次，即制成负载全细胞抗原的DC瘤苗。