[发明专利]一种人调节性T细胞的免疫抑制功能的检测方法

摘要

本发明公开了一种人调节性T细胞的免疫抑制功能的检测方法，该方法包括以下步骤采集外周血提取单个核细胞；使用荧光素标记的抗CD4和抗CD25抗体标记细胞表面抗原；再使用固定破膜剂固定细胞表面抗体；破膜后使用荧光素标记的抗Foxp3和抗Helios抗体标记细胞核内转录因子Foxp3和Helios；最后使用流式细胞仪检测CD4+CD25+FoxP3+Helios+ Treg细胞群。该方法通过快速检测儿童外周血中转录因子Helios的表达情况，直接分析外周血中调节性T细胞的功能。该方法使用抗Helios、抗CD4、抗CD25和抗FoxP3流式抗体，可以更快速准确的标记具有较强免疫抑制功能的外周血Treg细胞。

主权项

一种人调节性T细胞的免疫抑制功能的检测方法，其特征在于，具体检测步骤如下：1） 采集：取外周血5‑10ml；2） 处理样本：取流式管分别加入100μl外周血样本，每管加入2ml红细胞裂解液，混匀后室温孵育15分钟，1500转/分20℃离心5min洗涤1遍，加入2mlPBS液相同条件再次洗涤1遍，加入100μl PBS液重悬成单细胞悬液；3）表面抗体的标记：加入抗体CD4、CD25各5μl标记调节性T细胞表面分子标记，室温避光孵育20分钟，PBS液1500转/分20℃离心5min洗涤1遍； 4）细胞固定破膜：加入1ml 固定破膜剂：10%甲醛/0.2%Triton‑X/PBS重悬细胞，室温避光孵育1小时，加入2ml PBS液洗涤2遍； 5）核内抗体染色：加入100μl PBS液重悬细胞，加入核内抗体Foxp3、Helios各5ul标记核内抗体，室温避光孵育1小时，加入2ml PBS液洗涤2遍；6）流式检测：加入400μl的PBS液重悬成单细胞悬液，滤网过滤加入流式孔板，流式细胞仪上机检测CD4+CD25+FoxP3+Helios+细胞占CD4+细胞比例；7）单个核细胞分离：外周血全血样本按照体积比1：1的比例将外周血缓慢加入Ficoll淋巴细胞分离液中，2500转/分 离心25‑30分钟，收集中间白膜层的单个核细胞，加入15ml PBS液，1800转/分，离心10分钟，洗涤2遍；8）分选：磁珠分选CD4+CD25+Treg细胞，其中阴性分选CD4+细胞，阳性分选CD25+细胞，CFSE实验检测不同组CD4+CD25+Treg细胞对CD4+CD25‑Th细胞的免疫抑制功能；9）检测：构建Helios siRNA，将Helios siRNA转染到分选后的ALL CD4+CD25+Treg细胞中，CFSE实验检测Treg细胞免疫抑制功能。