[发明专利]一种丹红注射液体内代谢产物鉴定检测方法

摘要

本发明公开了一种丹红注射液体内代谢产物鉴定检测方法(1)取丹红注射液体尾静脉注射SD大鼠，不同时间点采血，离心分离血浆，血浆处理后，采用Qtrap液质联用仪对样品进行梯度洗脱分离，结合EMS‑IDA‑EPI、(p)MRM‑IDA‑EPI、NL/Pre‑IDA‑EPI等多种扫描模式结合强大的MetabolitePilot™代谢物鉴定软件来分析代谢产物。发现注射液中含量较高的有效成分丹参素，原儿茶酸，原儿茶醛，迷迭香酸的II相代谢物，主要是甲基化，硫酸化，甲基化后硫酸化，葡萄糖醛酸化等一系列代谢物。各代谢物含量随着给药时间的推移变化，大部分代谢物在10 min及30 min达Cmax，给药6 h后原药及代谢物已大部分消除。本发明所建立的一种丹红注射液体内代谢产物鉴定检测方法简单、重复性好、准确可靠，可为丹红注射液临床应用提供依据。

主权项

一种丹红注射液体内代谢产物鉴定检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1) 取丹红注射液尾静脉注射SD大鼠，注射量为10～12 mg/kg，在10min～6h各时间点眼眶采血，血样置肝素化离心管中，离心分离血浆；(2) 血样处理方法：微量加样器吸取血浆200μL，加甲醇：乙腈混合液，血浆与混合液体积比1：2.5～3，旋涡混合，离心，取上清作为样品待测；(3) 采用高效液相色谱‑三重四极杆线性离子阱串联质谱对样品进行检测分析，仪器条件如下：a、液相色谱条件：Shimadzu UFLC XR；流动相A: H2O (含0.05%FA+5mM NH4FA) ；流动相B: CH3OH:CH3CN(1:1)；流速:0.1～0.5 mL/min；进样体积: 4～10 uL；色谱柱: PoroShell 120 EC‑C18；柱温：40～70 ℃；梯度洗脱；b、质谱条件: AB SCIEX Qtrap 4500 System；扫描模式Scan Mode：ESI, NEG/POS；质谱模式MS mode：EMS (100～750)‑IDA‑EPI，MRM‑IDA‑EPI，Prec/NL‑IDA‑EPI；增强子离子扫描范围EPI Range：m/z 80‑750；动态填充时间Dynamic Fill Time：开启；动态背景扣除DBS：开启；气帘气CUR：30 psi；碰撞气CAD：Medium/High；喷雾电压IS：‑4500 V；离子源温度TEM：550 ℃；雾化气Gas1：50 psi；加热气Gas2：50 psi；(4) Qtrap液质联用仪结合IDA(数据依赖性扫描，自动采集MS2)信息相关扫描方式，EMS‑IDA‑EPI 筛查高含量的有效成分及代谢物，(p)MRM‑IDA‑EPI 高灵敏度的筛查目标有效成分及预测代谢物，NL/Pre‑IDA‑EPI 筛查具有特征中性丢失和特征子离子的代谢物；(p)MRM‑IDA‑EPI是三种扫描方式中灵敏度最高的模式，pMRM = Predictive MRM，预测性MRM检测，pMRM根据结构类似物或代谢物具有相同的碎片预测MRM；数据采集及处理：MetabolitePilot™代谢物鉴定软件。