[发明专利]一种采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的方法

摘要

本发明公开一种采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的方法，通过对枣实蝇mtDNA的COI基因片段进行测序，应用种特异引物PCR(SS‑PCR)和琼脂糖凝胶电泳(AGE)技术，筛选出了1对枣实蝇的特异性引物，特异引物序列分别为，CarF的引物序列为CTCAACTAAATTATTCCCCAGCA；CarR的引物序列为GGGTATCAATGCACAAATCCA；依据枣实蝇的卵、幼虫、蛹与其它实蝇类害虫形态的相近性，针对常见的实蝇类害虫桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇作为检验引物特异性的阴性对照，证明本发明设计的引物对枣实蝇的特异性，大大缩短了枣实蝇的鉴定周期，具有广泛的实用性。

主权项

一种采用特异性引物快速鉴定枣实蝇的方法，其特征在于，具体方法步骤如下：(1)枣实蝇基因组DNA的提取：选用枣实蝇的标本，采用试剂盒推荐的方法来提取基因组DNA和测序；(2)枣实蝇的特异性引物设计：以目标枣实蝇线粒体DNA(mtDNA)中COI基因序列为目标序列，序列号为HQ687210，借助常用的CLUSTAL方法，与已知其它种类的实蝇的COI基因序列进行比较分析，序列号为FJ571364.1、FJ571365.1和GQ175824.1，利用primer5人工设计引物，引物用primer5软件检查引物错配、二聚体和发夹结构，并用GenBank中提供的Blast程序检查同源序列，通过筛选获得能特异鉴定枣实蝇的特异引物CarF和CarR一对，特异引物序列分别为：CarF的引物序列为CTCAACTAAATTATTCCCCAGCA；CarR的引物序列为GGGTATCAATGCACAAATCCA；引物筛选的原则是所有引物在标准的SS‑PCR的反应体系和反应条件下，能特异地鉴定出枣实蝇；(3)DNA质量检查：枣实蝇DNA提取质量用引物对can‑F/can‑R来检查；引物序列为can‑F：AAGAGCGACGGGCGATG；can‑R：CTAGGATTAGATACCCTATT；该引物对是专门用于检查实蝇类昆虫模板DNA质量的通用引物，经过PCR反应后，分别提取PCR产物5μL在含溴化已锭的1.5％琼脂凝胶多功能电泳仪上在90V电压下电泳30min，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度，确切的DNA浓度通过核酸蛋白检测仪测定；(4)SS‑PCR引物的种特异性检验：分别以单头桔小实蝇，番石榴实蝇，瓜实蝇，南瓜实蝇，桃果实蝇的DNA为模板，枣实蝇为阳性对照，检验枣实蝇特异片段扩增引物CarF和CarR的种特异性；SS‑PCR在定量梯度PCR仪上进行，反应体系：10mmol/L10×Buffer，0.25mmol/LMg2+，0.25mmol/LdNTP，上下游引物各0.1umol/L，1UTaq酶，模板DNA1μL，加水至总体积25μL，反应条件为94℃/5min，95℃/40s，57℃/30s，72℃/1min，33个循环，最后72℃延伸5min；分别提取PCR产物5μL在含溴化已锭的1.5％琼脂凝胶多功能电泳仪上在90V电压下电泳30min，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度；(5)SS‑PCR引物对不同虫态的扩增效果以及灵敏度检测：分别以提取的幼虫、蛹和成虫不同虫态的枣实蝇DNA为模板，进行靶标片段扩增效果检验，取不同浓度的成虫DNA模板进行最低检出阈值的测定，SS‑PCR方法的检测限度达0.1pg以下，最适模板DNA浓度为1～20ng。