[发明专利]一种海胆致病菌强壮弧菌的检测方法

摘要

一种海胆致病菌强壮弧菌的检测方法，用于检测的三组探针VF2、VF3和VF4，探针序列如下：VF2(5’‑3’)：CGTTATCAACTTGCGATGCTGTAGGGGTG；VF3(5’‑3’)：CTTAGCTGCCTAACTTCTTGAGAACGAACC G；VF4(5’‑3’)：GGTGTCGTTAATAGCGGCATCTCTTGA；将探针经氨基修饰后，制成基因芯片，将待测样品DNA提取后，进行PCR扩增后，进行荧光标记，与基因芯片杂交后，利用扫描仪检测结果。优点是：该方法能快速高效检测海胆致病菌强壮弧菌，并且特异性高和敏感性强的特点，提高了鉴定海胆养殖区环境及生物体致病菌强壮弧菌的能力。

主权项

一种海胆致病菌强壮弧菌的检测方法，其特征是：具体步骤是：(1)基因芯片的制作用于检测的三组探针VF2、VF3和VF4，探针序列如下：VF2(5’‑3’)：CGTTATCAACTTGCGATGCTGTAGGGGTG；VF3(5’‑3’)：CTTAGCTGCCTAACTTCTTGAGAACGAACCG；VF4(5’‑3’)：GGTGTCGTTAATAGCGGCATCTCTTGA；将VF2、VF3和VF4探针在5’端加上15个T的间隔臂，并在探针5’端进行氨基修饰；用双蒸水将经氨基修饰的探针稀释成100μmol/L的母液，再用点样缓冲液稀释至浓度20μmol/L；使用点样仪在醛基化基片上进行非接触式点样，然后将点样后的芯片放到盛有探针固定增效剂的可密闭的敞口容器内，密闭后静置于30℃烘箱过夜，得到用于检测海胆致病菌强壮弧菌的基因芯片；(2)待测样品DNA提取将环境中的水样、泥样或生物样品进行取样，然后提取待测样品的DAN，备用；(3)样品PCR扩增用于检测强壮弧菌(Vibrio fortis)引物是：VF2和VF3探针使用的引物基因序列如下：上游引物：CTTTACTCGCGTAACCTTGA；下游引物：CCATCGTAGCCCTTTCTGT；VF4探针使用的引物基因序列如下：上游引物：CTGGAACTGAGACACGGTCC；下游引物：GGAGTTAGCCGGTGCTTCTT；将步骤(2)提取的样品的DNA作为扩增模板，分别以探针对应的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；(4)PCR扩增产物与芯片杂交将PCR扩增产物进行荧光标记，将基因芯片进行预杂交，然后，将经荧光标记后的PCR扩增产物与经预杂交的基因芯片进行杂交，离心干燥后，放于微阵列芯片扫描仪上检测，收集检测结果，在探针点样位置具有特异性信号，判定为阳性，在探针点样位置未出现特异性信号，为阴性。