[发明专利]外排泵SMeDEF与Ⅰ类整合酶基因联合介导嗜麦芽寡养单胞菌多重耐药基因定位的方法

摘要

本发明涉及一种外排泵SMeDEF与Ⅰ类整合酶基因联合介导嗜麦芽寡养单胞菌多重耐药基因定位的方法，属于医学技术领域。本发明提供的外排泵SMeDEF与Ⅰ类整合酶基因联合介导嗜麦芽寡养单胞菌多重耐药基因定位的方法，对嗜麦芽寡养单胞菌多药耐药菌株进行整合子及外排泵筛选及其特性分析；采用实时PCR、间隔重复序列、Southern方法对嗜麦芽寡养单胞菌的整合子和外排泵阳性菌株进行基因指纹图谱分析，确定其Ⅰ类整合子和外排泵特性与基因型的关系，确定基因定位，实现了嗜麦芽寡养单胞菌多重耐药基因定位，将对开发能够控制细菌耐药基因盒地捕获和表达的抗生素佐剂，寻找有效耐药逆转策，提供有力证据。

主权项

一种外排泵SMeDEF与Ⅰ类整合酶基因联合介导嗜麦芽寡养单胞菌多重耐药基因定位的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对收集到的嗜麦芽寡养单胞菌重新鉴定和药敏检测，确立标准菌株；(2)将标准菌株分别接种于仅含不同浓度环丙沙星的琼脂平板、同时含碳酰氰基‑对‑氯苯腙(CCCP)和不同浓度环丙沙星的琼脂平板、以及仅含CCCP的琼脂平板上，进行外排表型鉴定，筛选出外排泵基因阳性菌株；(3)选用外排泵基因阳性菌株提取并纯化细菌基因组DNA作为扩增模版，铜绿假单胞ATCC25783作为阴性菌株，采用RT‑PCR进行嗜麦芽寡养单胞菌的外排泵编码基因SMeDEF检测；(4)采用RT‑PCR和菌落杂交实验检测嗜麦芽寡养单胞菌的外排泵编码基因SMeDEF阳性菌株的Ⅰ类整合酶基因；(5)利用质粒图谱、核酸内切酶图谱进行外排泵编码基因SMeDEF、Ⅰ类整合酶基因比对分析，确定外排泵SMeDEF与Ⅰ类整合酶基因联合介导耐药基因；(6)将质粒DNA和酶切的染色体DNA与经过地高辛标记的Ⅰ类整合酶基因及外排泵编码基因SMeDEF进行分子杂交实验，完成嗜麦芽寡养单胞菌多重耐药基因定位。