[发明专利]基于位点特异性重组的四膜虫表达载体及其构建和应用有效
| 申请号： | 201710217711.8 | 申请日： | 2017-04-05 |
| 公开（公告）号： | CN107012146B | 公开（公告）日： | 2020-02-14 |
| 发明（设计）人： | 许静;王伟;薄涛;杨焕 | 申请（专利权）人： | 山西大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C07K1/14;G01N33/68 |
| 代理公司： | 14105 山西五维专利事务所(有限公司) | 代理人： | 张福增 |
| 地址： | 030006 山*** | 国省代码： | 山西;14 |
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| 摘要： | 本发明公布了一种基于位点特异性重组的四膜虫表达载体及其构建和应用。该载体以质粒pNeo4为骨架，组合串联的HA标签序列、限制性内切酶酶切位点及四膜虫ACTIN1基因的转录终止序列为模块，将模块合成、酶切位点消化插入到pNeo4的5'端多克隆酶切位点中，构建出表达载体pNeo4‑3HA。使用该载体时，分别扩增获得重组同源臂—目的基因编码区C端序列及其3'侧翼序列，经酶切连接克隆到pNeo4‑3HA载体的5'上游和3'下游多克隆酶切位点中。得到的构建体经转化四膜虫、抗性筛选获得表达突变细胞株。本载体实现了在自身启动子调控下C端表达融合标签的内源基因的目的，操作简单快捷，3个HA标签提高了免疫荧光定位灵敏度，还可用于蛋白亲和纯化和蛋白相互作用研究。 | ||
| 搜索关键词： | 多克隆酶切位点 表达载体 构建 限制性内切酶酶切位点 位点特异性重组 蛋白相互作用 免疫荧光定位 突变细胞株 自身启动子 侧翼序列 抗性筛选 酶切位点 模块合成 目的基因 内源基因 亲和纯化 融合标签 转录终止 编码区 构建体 灵敏度 同源臂 可用 扩增 酶切 质粒 串联 蛋白 克隆 消化 上游 调控 转化 应用 研究 | ||
【主权项】：
1.一种表达载体pNeo4-3HA，含有核苷酸序列为SEQ ID NO：1的3HA-motif；所述3HA-motif通过以下步骤设计合成：在Sac1和Not1酶切位点之间加入18个随机碱基；之后，在Not1后加一个A碱基，紧跟其后为3个优化密码子的HA序列和TGA三联体密码子；每两个HA序列之间加三个碱基做linker；之后在酶切位点Sal1和Pst1之间是嗜热四膜虫ACTIN1基因的3'-UTR和转录终止子序列。/n
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