[发明专利]区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法

摘要

本发明公开了一种区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法，该方法以PRRSV NSP2基因组为模板，针对N1、N2基因序列设计特异性引物，构建重组表达质粒PET‑32a‑N1N2；在重组菌E.coliBL21(DE3)中成功诱导表达，利用His柱层析纯化，得到纯度较高的融合蛋白；利用纯化的PET‑32a‑N1N2蛋白，建立可用于区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法。本发明的方法特异性强、稳定性高、快速便捷，为猪蓝耳病免疫抗体水平检测、疫情监控及流行病学调查提供了一种新的检测方法。

主权项

1.一种区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下实施步骤：T1：构建重组表达质粒PET‑32a‑N1N2以PRRSV NSP2基因组为模板，针对N1、N2基因序列设计特异性引物，其中针对N1基因序列设计的特异性引物核苷酸序列为：5’‑ACGCGTCGACAAGATCACACGCCCAAAAT‑3’，针对N2基因序列设计的特异性引物核苷酸序列为：5’‑CGCGGATCCTTATGCGAGGTAACATCACAAAC‑3’；通过PCR扩增得到目的片段，构建克隆质粒pMD‑18T‑N1N2，对克隆载体和原核表达载体pET‑32a同时进行双酶切，连接后得到重组表达质粒pET‑32a‑N1N2；T2：对目的蛋白进行表达及纯化将构建重组表达质粒PET‑32a‑N1N2转入E.coliBL21(DE3)，诱导表达融合蛋白，利用His柱层析进行纯化，得到经SDS‑PAGE电泳分析纯度较高的蛋白；T3：建立间接ELISA检测方法利用纯化的PET‑32a‑N1N2蛋白，建立间接ELISA检测方法，确定PET‑32a‑N1N2蛋白抗原的包被浓度为0.075μg/孔，包被条件为4℃过夜；血清的稀释度和反应时间分别为1:200和37℃60min；封闭液为1％BSA，封闭时间为37℃60min；羊抗猪IgG‑HRP使用浓度和反应时间分别为1:5000和37℃60min；底物25℃避光反应20min。