[发明专利]一种应用干细胞自身特性制备牙髓干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种应用干细胞自身特性制备牙髓干细胞的方法，该方法包含步骤1抽取牙髓分成若干小块，放入离心管内；步骤2配制消化液加入到离心管内进行消化；步骤3终止消化；步骤4离心，去除上清液，在底部的沉淀加入MSC原代培养基，重悬后移至培养瓶中，进行原代培养；步骤5当细胞融合度达到80%‑90%时，收集上清液，将该干细胞提取液加入到MSC原代培养基中，得到传代培养基；步骤6进行胰酶消化，消化时间不超过1min，终止消化；步骤7种瓶，进行传代培养；步骤8重复上述步骤6和7进行若干次传代培养；步骤9细胞冻存。本发明的方法缩短了原代培养的时间，而且增殖能力强，制备的牙髓干细胞具有很好的干细胞特征，分化潜力强。

主权项

一种应用干细胞自身特性制备牙髓干细胞的方法，其特征在于，该方法包含：步骤1：选取牙齿样本，破牙冠，从牙齿样本的髓腔中抽取牙髓，使用缓冲溶液洗涤牙髓，将牙髓分成若干小块，放入离心管内；步骤2：配制消化液，该消化液包含：氯化钠注射液、胶原酶Ⅰ、分散酶Ⅱ、白蛋白、镁盐和钙盐，将该消化液加入步骤1中的离心管内，将离心管密封，混合均匀后在37℃下消化；步骤3：待离心管内的小块被消化松散后，对离心管表面灭菌处理，加入消化终止液，终止消化；步骤4：将步骤3得到的溶液进行离心，去除上清液，在底部的沉淀加入MSC原代培养基，使沉淀重悬后转移至培养瓶中，在5%CO2， 37℃下，进行原代培养；步骤5：当细胞融合度达到80%‑90%时，收集上清液，并进行超滤，收集上层滤网中的干细胞提取液，将该干细胞提取液加入到MSC原代培养基中，得到传代培养基；步骤6：将步骤5中下层沉淀的细胞接种到培养瓶中，待细胞融合度达到80%‑90%时，将培养瓶内的培养基移出备用，用磷酸盐缓冲液冲洗培养瓶，在培养瓶中加入稀释的胰酶，将胰酶平铺于培养瓶底部，进行胰酶消化，消化时间不超过1min，加入上述备用的培养基终止消化；稀释的胰酶为浓度为0.025%的胰酶；步骤7：将步骤6消化得到的液体离心，底部沉淀的细胞加入到步骤5得到的传代培养基中，混合均匀，按1×102/cm2的细胞密度进行种瓶，在5%CO2，37℃的条件下进行传代培养；步骤8：重复上述步骤6和7，进行若干次传代培养；步骤9：将细胞冻存液置于冻存管中，在4℃下进行预冷，冻存管中加入步骤8细胞扩大培养得到的干细胞传代培养基，细胞密度为1.5×106~2×106/1.5mL/管，逐渐降温至‑80℃，24h之后将冻存的细胞放入‑196℃的液氮罐中保存；其中，所述的MSC原代培养基中包含：生长因子。