[发明专利]一种乙草胺检测酶联免疫试剂盒

摘要

本发明涉及一种乙草胺检测酶联免疫试剂盒，包括酶标板、酶标记物工作液、乙草胺特异性抗体浓缩液、洗涤工作液、复溶工作液和TMB显色液，其中，所述酶标板的微孔条上预包被乙草胺偶联抗原，所述酶标记物工作液为酶标记抗抗体工作液。本发明乙草胺检测酶联免疫试剂盒，是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，与传统仪器分析技术相比，具有检测快速、简便、准确，低成本以及检测灵敏度高等特点，能最大限度地减少操作误差和工作强度。

主权项

1.一种乙草胺检测酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括酶标板、酶标记物工作液、乙草胺特异性抗体浓缩液、洗涤工作液、复溶工作液和TMB显色液，其中，所述酶标板的微孔条上预包被乙草胺偶联抗原，所述酶标记物工作液为酶标记抗抗体工作液，具体为：(1)洗涤工作液，浓缩洗涤液1：19体积比稀释而成，所述浓缩洗涤液为pH值为7.1～7.5，含有0.8％～1.2％吐温‑20、0.01％～0.03％硫柳汞防腐剂、0.01～0.03mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；(2)复溶工作液，浓缩复溶液1：1体积比稀释而成，pH值为7.2～7.7，含有8％～12％卵清蛋白、0.1～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；(3)TMB显色液，包括TMB底物液A液和TMB底物液B液，A液为过氧化氢，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺；(4)终止液，0.5mol/L的盐酸缓冲液；(5)酶标板为96孔酶标板，其中在酶标板制备过程中所用的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，所用封闭液为pH值为9.1～9.5，含有3％～10％小牛血清、0.2％吐温‑20、0.1～0.3mol/L的碳酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；酶标板的制备过程为，用包被缓冲液将包被原稀释成0.1～0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液37℃温育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空；(6)其中，乙草胺特异性抗体的制备流程为：将这两种抗原注入到小鼠进行免疫反应，最终得到两种针对不同乙草胺结构的抗体；乙草胺抗原1的合成方法是：乙草胺溶于甲氢呋喃中，氮气保护下加热搅拌加入巯基丙酸，K2CO3做催化剂，用TLC薄层板监测反应进行，直至没有原料或原料点很浅，停止反应，净化，甲醇重结晶，得水解产物；称取30mg半抗原溶解于2mLDMF溶液中，加入各溶于2mL水中的60mgEDC和NHS进行活化30分钟，加入到溶于5mL水中的110‑264mg载体蛋白BSA进行偶联制备出免疫原，用0.02mol/LPB缓冲液透析3天，每天早晚更换透析液，透析完成后用于动物免疫制备出抗体；乙草胺抗原2的合成方法是：将1.5g乙草胺加入到浓硫酸与浓硝酸的混酸中，浓硫酸与浓硝酸体积比为v/v＝30/70,室温下搅拌反应，反应完全后，加入氢氧化钠调pH至中性，抽滤水洗，干燥得反应产物1.45g，将产物溶于甲醇中，通入氢气，加入0.1钯‑碳催化反应，反应完成后抽滤浓缩得产物1.3g，产物1.3g溶于干燥四氢呋喃溶液中，加入0.5g丁二酸酐，0.1gDMAP(4‑二甲氨基吡啶)作催化剂进行反应，反应完成后，提纯最终得半抗原；称取以上半抗原0.1g，分别溶解于3mLN,N‑二甲基甲酰胺溶液，分别加入NHS(N‑羟基丁二酰亚胺)/EDC(1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐)混合水溶液，活化4小时；活化后溶液分别加入到含有BSA(牛血清白蛋白)220mg的BSA溶液中，调pH8.5，室温反应24小时，转到透析袋中于0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶液中透析3天，每天早晚换液；上述得到的两种抗原，将如下两种抗原注入到小鼠/兔子进行免疫反应，最终得到两种针对不同乙草胺结构的抗体；(7)酶标二抗工作液，本实施例酶标二抗采用羊抗鼠抗抗体，以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原，对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；酶标二抗通过稀释，酶标二抗得到工作液；(8)乙草胺标准溶液，浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L和40.5μg/L；其中标准品稀释液为PH值7.4的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。