[发明专利]一种降解双酚类含氮污水的异养硝化好氧反硝化菌的复壮方法

摘要

本发明属于环境微生物技术领域，涉及到菌株的复壮，特别涉及到一种处理双酚类含氮污水的异养硝化好氧反硝化菌的复壮方法。采用含普通碳源的培养基进行培养，逐渐加入双酚类含氮配水并提高其配比，使得微生物经过一个循序渐进的驯化过程并逐渐恢复其对双酚类污染物的适应能力，最后得到以双酚类污染物为碳源的异养硝化好氧反硝化菌株。该方法相对于直接用含普通碳源的培养基或双酚类含氮配水反复培养进行复壮的方法，复壮的成功率更高，而且该方法在操作上简单易行，耗时较少。并且利用双酚类污染物的降解情况、氨氮去除率及其转化为气态氮的转化率等作为评价复壮菌株性能的指标，比较全面。

主权项

一种降解双酚类含氮污水的异养硝化好氧反硝化菌的复壮方法，其特征在于，步骤如下：(1)对需要复壮的菌种进行驯化培养：(1.1)配制液体培养基I，各种物质的浓度配比为：(NH4)2SO4 0.1‑0.5g/L、柠檬酸钠1‑3g/L、乙酸钠1‑3g/L、K2HPO4·2H2O 5‑6g/L、KH2PO4 2‑3g/L、MgSO4·7H2O 0.2‑0.8g/L、CaCl2 0.02‑0.1g/L，pH调节至6.8‑7.2；(1.2)配制双酚类含氮配水，各种物质的浓度配比为：(NH4)2SO4 0.01‑0.02g/L、双酚类物质0.2‑0.5g/L、K2HPO4·2H2O 5‑6g/L、KH2PO4 2‑3g/L、MgSO4·7H2O 0.2‑0.8g/L、CaCl2 0.02‑0.1g/L，pH调节至6.8‑7.2；将配制的液体培养基I和双酚类含氮配水进行灭菌处理；(1.3)在无菌条件下配制三类液体培养基：第一类为100％体积的液体培养基I；第二类包括多个液体培养基，每个由不同体积比例的液体培养基I和双酚类含氮配水配成，并且液体培养基I所占的体积比例按递减的顺序配制，液体培养基I的体积比例范围为90％～10％；双酚类含氮配水所占的体积比例按递增的顺序配制，双酚类含氮配水的体积比例范围为10％～90％；第三类为100％体积的双酚类含氮配水；将配好的三类液体培养基进行灭菌处理；(1.4)将需要复壮的异养硝化好氧反硝化菌种进行逐步驯化培养，首先使用第一类液体培养基，驯化培养1‑2d；再更换到第二类液体培养基中，从双酚类含氮配水占第二类液体培养基的体积的10％开始，逐渐增加双酚类含氮配水的体积比例，直到双酚类含氮配水占第二类液体培养基的体积的90％，每增加一次，驯化培养1‑2d；最后更换第三类液体培养基，驯化培养1‑2d；驯化培养的具体步骤：在无菌条件下，首先用磷酸盐缓冲液将需要复壮的异养硝化好氧反硝化菌种清洗并离心2‑3次，去掉上清液；接着加入磷酸盐缓冲液进行震荡重悬，得到均匀菌液，移取菌液接种至步骤(1.3)配制的液体培养基中，使得初始菌种的浓度为OD600＝0.1‑0.15，最后将液体培养基置于无菌、30‑35℃、100‑150rpm的条件下进行驯化培养；其中，磷酸盐缓冲液中各物质的浓度配比为：K2HPO4·2H2O 5‑6g/L、KH2PO4 2‑3g/L，将磷酸盐缓冲液pH调节至6.8‑7.2；离心条件为：8000‑10000×g、5min、4℃；OD600为在600nm波长下测得的异养硝化好氧反硝化菌菌浓度；(2)对驯化培养后的细菌进行分离纯化：配制固体培养基，各种物质的浓度配比为：(NH4)2SO4 0.1‑0.5g/L、柠檬酸钠1‑3g/L、乙酸钠1‑3g/L、K2HPO4·2H2O 5‑6g/L、KH2PO4 2‑3g/L、MgSO4·7H2O 0.2‑0.8g/L、CaCl2 0.02‑0.1g/L、琼脂20g/L，pH调节至6.8‑7.2；用平板划线法将驯化培养后的异养硝化好氧反硝化菌接种至灭菌固体培养基，将平板倒置于30‑35℃恒温培养箱中培养2‑3d以得到单一菌落；(3)对有效菌种进行初筛：A.挑取平板中的单一菌落分别接种至第一类液体培养基中，将接种后的第一类液体培养基置于30‑35℃、100‑150rpm条件下恒温震荡培养1‑2d，取样测定氨氮及总氮去除率；B.对测定的氨氮及总氮去除率水平达到菌种正常去除水平80％以上的菌株，以OD600为0.1‑0.15的接种量分别接种至第三类液体培养基中，将接种后的第三类液体培养基置于30‑35℃、100‑150rpm条件下恒温震荡培养2‑3d，取样测定双酚类污染物、氨氮及总氮去除率；重复步骤B，直到测定的双酚类污染物、氨氮及总氮去除达到退化前正常去除水平并保持稳定；(4)对有效菌种进行氮平衡分析：将步骤(3)中得到的菌株以OD600为0.1‑0.15的接种量接种至双酚类含氮配水中，并接入氧气和氦气体积比3：7组成的混合气进行曝气，待曝气10‑20min之后将反应体系进行密封处理，于30‑35℃培养箱中静止培养2‑3d；产生的气体用气相色谱法测定，得到N2和N2O的浓度；测定液体部分总氮、氨氮、硝态氮及亚硝态氮的浓度，用冷冻干燥法处理菌体部分，测定菌体细胞内有机氮的浓度，通过对氮素的定量计算确定菌株对氨氮的代谢特性，得到高效降解双酚类含氮污水的异养硝化好氧反硝化菌株。