[发明专利]一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用有效
申请号: | 201710252018.4 | 申请日: | 2017-04-18 |
公开(公告)号: | CN106834217B | 公开(公告)日: | 2021-07-09 |
发明(设计)人: | 肖建辉;田亚冰 | 申请(专利权)人: | 遵义医学院附属医院 |
主分类号: | C12N5/073 | 分类号: | C12N5/073;C12N5/071 |
代理公司: | 遵义浩嘉知识产权代理事务所(普通合伙) 52112 | 代理人: | 李雪梅 |
地址: | 563003 *** | 国省代码: | 贵州;52 |
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摘要: |
本发明涉及一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法,该方法为在人羊膜上皮细胞培养过程中添加营养组合物,该营养组合物主要包括透明质酸、表皮细胞生长因子、维生素C、GlutaMAX™‑I添加剂、 |
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搜索关键词: | 一种 促进 羊膜 上皮细胞 体外 扩增 方法 应用 | ||
【主权项】:
一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法,其特征在于:所述促进人羊膜上皮细胞体外扩增的具体步骤为:(1) 经产前检查排除乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒和获得性免疫综合征的健康产妇知情同意,获取足月剖宫产新鲜胎盘;无菌条件下,剥离羊膜组织,然后采用机械‑酶法分离制备人羊膜上皮细胞;即用新鲜配制的含青霉素和链霉素的D‑Hank’s液反复冲洗羊膜组织,除去残留血渍,剪碎羊膜,加入含0.02%EDTA的 0.05% 胰蛋白酶溶液,37℃,200rpm旋转消化10 min,弃去消化液;再加入新鲜消化液,37℃,200rpm旋转消化30 min,300目不锈钢网过滤,收集单细胞悬液,加入含10%胎牛血清的培养基终止消化;同理处理2次,合并收集的单细胞悬液,1500 rpm离心10 min,弃上清,细胞沉淀含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重新悬浮,制备得到原代人羊膜上皮细胞;2%台盼蓝染色检测细胞活力,取部分样品作进行细胞表型鉴定;(2) 把原代人羊膜上皮细胞按一定密度种于培养瓶中,培养基是含10%胎牛血清的低糖DMEM,在35~37℃,含1~10% CO2及85~100%空气饱和湿度恒温培养箱内进行原代细胞培养,并在其中添加营养组合物,每1~3天换一次培养基和营养组合物;待培养板或培养瓶中细胞生长融合度达到80~90%时,用含0.02%EDTA的 0.125% 胰蛋白酶溶液,37℃孵育2~5min,显微镜下观察消化程度,及时用含10% FBS 的培养基终止消化,1500r/min,离心5min,弃上清,培养基重悬;再按一定密度种于培养瓶中,加入营养组合物,每1~3天换一次培养基和营养组合物,进行传代培养。
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