[发明专利]一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用有效

专利信息
申请号: 201710252018.4 申请日: 2017-04-18
公开(公告)号: CN106834217B 公开(公告)日: 2021-07-09
发明(设计)人: 肖建辉;田亚冰 申请(专利权)人: 遵义医学院附属医院
主分类号: C12N5/073 分类号: C12N5/073;C12N5/071
代理公司: 遵义浩嘉知识产权代理事务所(普通合伙) 52112 代理人: 李雪梅
地址: 563003 *** 国省代码: 贵州;52
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摘要: 发明涉及一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法,该方法为在人羊膜上皮细胞培养过程中添加营养组合物,该营养组合物主要包括透明质酸、表皮细胞生长因子、维生素C、GlutaMAX™‑I添加剂、β‑巯基乙醇、甘氨酸、L‑丙氨酸、L‑天冬氨酸、L‑天冬酰胺、L‑谷氨酸、L‑脯氨酸、L‑丝氨酸等,其能显著促进人羊膜上皮细胞增殖,减少倍增时间,并维持人羊膜上皮细胞的细胞表面标志物表达、多向分化潜能和免疫耐受等生物学特性,而且还能显著增强人羊膜上皮细胞干性相关基因和免疫抑制因子的表达水平。因此,本发明营养组合物作为人羊膜上皮细胞增殖调节剂优势特色明显,对缓解再生医学领域种子细胞数量不足具有重要的临床意义。
搜索关键词: 一种 促进 羊膜 上皮细胞 体外 扩增 方法 应用
【主权项】:
一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法,其特征在于:所述促进人羊膜上皮细胞体外扩增的具体步骤为:(1) 经产前检查排除乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒和获得性免疫综合征的健康产妇知情同意,获取足月剖宫产新鲜胎盘;无菌条件下,剥离羊膜组织,然后采用机械‑酶法分离制备人羊膜上皮细胞;即用新鲜配制的含青霉素和链霉素的D‑Hank’s液反复冲洗羊膜组织,除去残留血渍,剪碎羊膜,加入含0.02%EDTA的 0.05% 胰蛋白酶溶液,37℃,200rpm旋转消化10 min,弃去消化液;再加入新鲜消化液,37℃,200rpm旋转消化30 min,300目不锈钢网过滤,收集单细胞悬液,加入含10%胎牛血清的培养基终止消化;同理处理2次,合并收集的单细胞悬液,1500 rpm离心10 min,弃上清,细胞沉淀含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重新悬浮,制备得到原代人羊膜上皮细胞;2%台盼蓝染色检测细胞活力,取部分样品作进行细胞表型鉴定;(2) 把原代人羊膜上皮细胞按一定密度种于培养瓶中,培养基是含10%胎牛血清的低糖DMEM,在35~37℃,含1~10% CO2及85~100%空气饱和湿度恒温培养箱内进行原代细胞培养,并在其中添加营养组合物,每1~3天换一次培养基和营养组合物;待培养板或培养瓶中细胞生长融合度达到80~90%时,用含0.02%EDTA的 0.125% 胰蛋白酶溶液,37℃孵育2~5min,显微镜下观察消化程度,及时用含10% FBS 的培养基终止消化,1500r/min,离心5min,弃上清,培养基重悬;再按一定密度种于培养瓶中,加入营养组合物,每1~3天换一次培养基和营养组合物,进行传代培养。
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