[发明专利]一种检测大肠杆菌的荧光定量PCR方法

摘要

本发明公开了一种检测大肠杆菌的荧光定量PCR方法，包括如下步骤：S1、根据目的基因序列设计特异性的引物和荧光探针；S2、选取大肠杆菌样品，提取样品的DNA/RNA；S3、将提取得到的RNA转换成cDNA，S4、使用紫外分光光度计检测上一步中提取物，本发明具有的优点如下：1、能够准确高效地提取出高纯度的大肠杆菌DNA，有助于提高实验结果的准确性；2、通过利用双标准曲线法，构建标准曲线方程，从而计算出样品中大肠杆菌的数量；3、提供了灵活的、操作简便的且快速高效的检测体系，能够用于大肠杆菌的定性和定量检测。

主权项

一种检测大肠杆菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、根据目的基因序列设计特异性的引物和荧光探针如下：引物A：5’‑TGGCATGACGTTATAGGCTACAAT‑3’；引物B：5’‑AGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCT‑3’；引物C：5’‑TGCTATTCTAACTGGGCTAATAAG‑3’；引物D：5’‑AGCTATTCTATCTCTGCTAATAAC‑3’；探针P：5’‑FAM‑ATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT‑BHQ1‑3’；S2、选取大肠杆菌样品，提取样品的DNA/RNA；S3、将提取得到的RNA转换成cDNA，其具体步骤如下：A1、取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管，取4‑6μgRNA提取物加入离心管，在60‑65℃环境中保温5min，然后冰浴6‑8min；A2、在离心管中依次加入下列组份：RNase抑制剂(40u/μL)0.5μL，10×M‑MLVReactionBuffer2μL，DTT(200mM)1μL和逆转录酶(M‑MLV)1μL；A3、将离心管内部组份轻轻混匀后，进行离心操作；A4、将离心得到的产物放入恒温箱，先在40℃保温1‑2h，然后72℃保温20‑30min，最后在‑20℃环境中保存留用；S4、使用紫外分光光度计检测上一步中提取物，检测结果保证1.7＜OD260/OD280＜1.9，以保证提取物为纯DNA，结果不满足则说明含有RNA和蛋白质杂质，需要重新提取；S5、荧光定量PCR，取大肠杆菌DNA 2μL，10μmol/L的引物A和引物B各3μL，10μmol/L的探针P0.5μL，2×TaqMan Universal Master Mix 10μL，再加入ddH2O补充至25μL，混合均匀后转移到加热箱中进行加热，其加热保温过程为：先在55‑60℃环境中保温1min，之后使用96‑100℃加热5‑6min，之后转到80‑88℃加热5min，最后采用70℃保温1min，进行55‑60个循环，在58℃进行单点荧光检测；S6、采用双标准曲线法，对样品检测的CT值进行实验结果分析：A、无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含大肠杆菌；B、Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含大肠杆菌；C、当Ct值＞35.0，则该样品做重复实验；重复实验结果无Ct值则该样品中不含大肠杆菌；若重复实验结果有Ct值，则该样品中含大肠杆菌。