[发明专利]一种青年猪胰岛分离方法及分离用消化液

摘要

本发明公开了一种青年猪胰岛分离方法及分离用消化液。所述的消化液在使用以基础培养基或者平衡盐溶液为液相添加了常规消化酶的基础上添加了DNase Ⅰ、中性蛋白酶、Ⅰ、Ⅲ型胶原酶、CaCl₂、Trolox、生长抑素等。同时在做胰岛分离时改变传统灌注消化法，变为剪碎组织消化法，以提高青年猪胰岛得率。本发明在不影响猪胰岛细胞功能的情况下，能够稳定提高胰岛细胞得率、降低经济成本，并且易于操作，降低污染概率。

主权项

1.一种青年猪胰岛分离方法，其特征在于，采用剪碎组织的方式进行消化，消化液是在以基础培养基或者平衡盐溶液为液相添加了常规消化酶的基础上加入DNaseⅠ，中性蛋白酶，Ⅰ、Ⅲ型胶原酶，CaCl₂，Trolox，生长抑素；所述的消化液中加入5~10U/ml DNaseⅠ，4000‑12000U/g中性蛋白酶，浓度均为0.1~0.5mg/ml的Ⅰ、Ⅲ型胶原酶，1~10 mM CaCl₂，1~10mM Trolox，1~5ug/ml生长抑素；所述的常规消化酶为Ⅴ型胶原酶，添加浓度为0.1~1mg/ml；所述的基础培养基为RPMI1640，所述的平衡盐溶液为HBSS；具体为以下步骤：1）将冷缺血时间＜30min的青年猪胰腺沁入碘酒，生理盐水后转移到无菌托盘中，托盘保持冰浴；2）去除胰腺的淋巴和结缔组织；3）将胰腺转入50ml无菌离心管中称重并记录；4）加10ml缓冲液，剪刀剪碎胰腺组织直径为3~5mm，取胰腺重量2~5g，加缓冲液至50ml、混匀，200g离心1min，弃上清30~35ml，重复一次；5）剪碎组织中加25~30ml消化液后继续剪至组织直径为1~5mm；6）将剪碎的组织转移至250ml锥形瓶中，加消化液至100ml；7）锥形瓶封口，37℃、100rpm震荡15~20min，消化液变浑时加中和液至250ml中止消化；所述的中和液为含有5%猪血清的HBSS缓冲液；8）将40目金属滤网置于烧杯上，过滤步骤7）制备的组织消化液，并用10ml注射器活塞在金属滤网上进行研磨，直至滤完所有消化液；9）中和液清洗2次，200rpm、2min离心，弃上清；10）冷HBSS重悬，200rpm、2min离心，弃上清，重复2次；11）加入预冷的成熟培养基重悬沉淀组织，200rpm、2min离心；所述的成熟培养基为含有10%猪血清的RPMI1640培养基；12）成熟培养基重悬组织细胞，平均分至培养瓶中，37^oC 、5%CO₂培养，每只猪分4~6个T‑175的悬浮培养瓶。