[发明专利]一种人附红细胞体体外培养方法

摘要

本发明公开了一种人附红细胞体体外培养方法，该方法包括以下步骤阳性红细胞泥的制备；红细胞泥的制备；人附红细胞体的体外培养。人附红细胞体能够在完全培养液中生长、繁殖和传代。在RPMI‑1640培养液中添加40％的胎牛血清配制的完全培养液作为其最适培养环境，连续传至15代仍可感染正常红细胞。本发明成功建立人附红细胞体的体外培养体系，为以后进一步研究人附红细胞体生物学特性、药物敏感性提供方法。并为附红细胞体的分类学、血清学诊断及疫苗研制等研究提供平台。

主权项

一种人附红细胞体体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、阳性红细胞泥的制备：将PCR确定为阳性、且镜检感染率＞80％的血样，部分用无菌pH 7.2 PBS洗涤三次，每次以1500r/min离心10min，弃去上清，并加入等体积的阿氏液悬浮，4℃冰箱保存备用，部分血样加入150ml/L甘油，‑80℃超低温冻存备用；步骤2、红细胞泥的制备：PCR检测为阴性血样，部分血样用无菌pH 7.2 PBS洗涤三次，每次以1500r/min离心10min，弃去上清，并加入2倍体积的PBS液，50℃恒温水浴锅加热2min，1500r/min离心，弃去上清，沉淀用PBS液洗涤3次，1500r/min离心，弃去上清，并加入等体积的阿氏液悬浮，4℃冰箱保存备用，部分血样加入150ml/L甘油，‑80℃超低温冻存备用；步骤3、人附红细胞体的体外培养96孔细胞培养板中，每个培养孔中加入感染人附红细胞体的阳性红细胞泥2μl和红细胞泥18μl共20μl，与180μl完全RPMI‑1640培养液混合培养，每孔共200μl，红细胞终浓度为5％，轻轻混匀，每孔做三个重复，同时设立不添加阳性红细胞泥的对照组和空白对照，将培养板置于5％CO2恒温培养箱37℃进行培养，每隔12h从培养孔底部的3个不同位置吸取2μl红细胞及RPMI‑1640培养液进行涂片瑞氏染色镜检，检查红细胞感染情况，每24h更换一次RPMI‑1640培养液，小心的吸取每孔上清液140μl后，收集起来，然后添加完全培养液至每孔总体积达200μl；当红细胞感染率达80％以上时，则将孔内红细胞收集，留下2μl红细胞悬液，再加入红细胞泥18μl和RPMI‑1640培养液，总体积至200μl后混匀，使其感染率保持在3％，按原代培养条件进行培养，如果红细胞感染率没有达到80％，则继续培养，补入RPMI‑1640培养液至200μl，轻轻吹打混匀后继续培养观察，如感染率经几次观察后仍不达80％，观察培养孔的颜色，是否有溶血来决定是否传代。