[发明专利]一种共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌构建方法

摘要

本发明公开一种共发酵葡萄糖和木糖生产D‑乳酸的乳酸片球菌构建方法，属于基因工程领域。构建步骤包括，利用热敏型敲除系统在乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ZP26（保藏号为CGMCC NO.8665）基因组上整合了异源木糖异构酶、木酮糖激酶、转酮醇酶以及转醛醇酶编码基因；敲除磷酸转酮酶编码基因以阻断副产物乙酸生成；并通过适应性驯化策略显著提高了工程菌株共发酵葡萄糖和木糖的能力。本发明首次成功实现了乳酸片球菌中木糖代谢路径的构建，得到一株高效共发酵葡萄糖和木糖生产光学纯D‑乳酸的工程菌株，并命名为P.acidilactici ZY15，其保藏号为CGMCC NO.13612。

主权项

1.一种共发酵葡萄糖和木糖生产D‑乳酸的乳酸片球菌构建方法，步骤包括：(1)启动子与xylAB基因簇的优化：木糖异构酶(xylA)和木酮糖激酶(xylB)的编码基因是进行木糖代谢的两个最主要基因，xylA和xylB基因的表达水平直接决定了木糖的代谢速率，因此通过优化不同启动子和不同来源的xylAB对xylAB的基因表达水平进行了优化。(2)xylAB基因组整合表达：将步骤(1)中得到的最优的xylAB表达框，通过同源重组整合至乳酸片球菌ZP26基因组上。(3)磷酸转酮酶编码基因pkt的敲除：在步骤(2)得到的菌株基础上，通过同源重组敲除了磷酸转酮酶路径的关键基因pkt，以减少副产物乙酸生成。(4)转酮醇酶和转醛醇酶编码基因的整合：在步骤(3)得到的菌株基础上，通过同源重组将异源的转酮醇酶基因(tkt)和转醛醇酶基因(tal)整合至其基因组上。(5)适应性驯化：将步骤(4)得到的菌株，在木糖为唯一碳源的培养基中进行适应性驯化。