[发明专利]一种产虾青素基因工程菌的构建方法

摘要

本发明公开了一种产虾青素基因工程菌的构建方法，属于生物技术领域。本发明产虾青素基因工程菌的构建方法包括如下步骤将产虾青素质粒pFZ153转化内含质粒pMH1、pFZ81的MG1655大肠杆菌感受态细胞，得到产虾青素基因工程菌。本发明构建的产虾青素基因工程菌通过IPTG诱导表达后虾青素产量可达2.0 mg/L左右。

主权项

一种产虾青素基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：将产虾青素质粒pFZ153转化内含质粒pMH1、pFZ81的MG1655大肠杆菌感受态细胞，得到产虾青素基因工程菌；其中，产虾青素质粒pFZ153通过包括如下步骤的方法得到：（1）大肠杆菌来源的idi基因通过PCR扩增克隆到载体pET28a（+）上获得质粒pGZI，将idi基因片段从pGZI中用NdeI和XhoI切下插入到pETduet‑1相应位点获得pFZ87；（2）以pFZ87为模板用引物PagCrtY‑Idi‑R和PagCrtW‑pETduet‑F扩增质粒骨架；从CGMCC 1.2244基因组DNA扩增crtY和crtZ，引物分别为Idi‑PagCrtY‑F、CrtZ‑PagCrtY‑R，CrtY‑PagCrtZ‑F、CrtW‑PagCrtZ‑R；合成SEQ ID NO.1所示的CrtW，以其为模板用引物CrtZ‑BreCrtW‑F和BreCrtW‑R扩增crtW；crtY、crtZ、crtW和质粒骨架四个片段用Giboson方法连接获得pFZ152；（3）将合成序列分别如SEQ ID NO.2、3、4所示的crtE、crtB和crtI，将crtE、crtB和crtI分别克隆到pET28a(+)的NdeI和EcoRI位点获得pFZ21、pFZ22和pFZ23；（4）以构建pFZ152同样的方法分别以pFZ87、pFZ21、pFZ22、pFZ23为模板用引物PETduet‑NcoI‑R、pETduet‑EcoRI‑T7‑F，Duet‑PanCrtE‑F、PanCrtI‑CrtE‑R，PanCrtE‑CrtI‑F、PanCrtB‑CrtI‑R，PanCrtI‑CrtB‑F、Duet‑EcoRI‑PanCrtB‑R扩增质粒骨架、crtE、crtI和crtB，用Giboson方法连接获得质粒pFZ112；（5）将crtE‑crtI‑crtB用NdeI和EcoRI从pFZ112上切下插入到pFZ152对应的位点获得产虾青素质粒pFZ153；上述各引物序列如下：PagCrtY‑Idi‑R:CAGATCATACCGCGGCATAGTGTAATCCTCCTTTATTTAAGCTGGGTAAATG，PagCrtW‑pETduet‑F:CTTATGGCGTGGTGAGAGCTAACTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGC，Idi‑PagCrtY‑F:ACCCAGCTTAAATAAAGGAGGATTACACTATGCCGCGGTATGATCTGATTC，CrtZ‑PagCrtY‑R:GCATTCCAAATCCACAACATATAGTAATCCTCCTTCATTGCATCGCCTGTTGAC，CrtY‑PagCrtZ‑F:CAGGCGATGCAATGAAGGAGGATTACTATATGTTGTGGATTTGGAATGCCCTGA，CrtW‑PagCrtZ‑R:CCACTGCGGCGGTCATTACTCATTCCTCCTTTACTTCCCGGGTGGCGCGTC，CrtZ‑BreCrtW‑F:CGCCACCCGGGAAGTAAAGGAGGAATGAGTAATGACCGCCGCAGTGGCAGAG，BreCrtW‑R: GCGGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTAGCTCTCACCACGCCATAAG，PETduet‑NcoI‑R: CATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC，pETduet‑EcoRI‑T7‑F: TAACTAGTGAATTCGAGCTCGGCGCGCCTG，Duet‑PanCrtE‑F:GAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGACCGTGTGTGCGAAAAAAC，PanCrtI‑CrtE‑R:TCACCGTGGTCGGTTTCATGGTTAATTCCTCCTTTACGACACCGCTGCCAG，PanCrtE‑CrtI‑F:CTGGCAGCGGTGTCGTAAAGGAGGAATTAACCATGAAACCGACCACGGTGA，PanCrtB‑CrtI‑R:TCAGCAGGGACGGATTATTCATGAGTATTACCTCCTTTAAATCAGGTCTTCCAGCATC，PanCrtI‑CrtB‑F:GATGCTGGAAGACCTGATTTAAAGGAGGTAATACTCATGAATAATCCGTCCCTGCTGA，Duet‑EcoRI‑PanCrtB‑R:TTGTCGACCTGCAGGCGCGCCGAGCTCGAATTCACTAGTTAAACGGGGCGCTGCCAGAG。