[发明专利]一种抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞疫苗制备方法

摘要

本发明提供了一种抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞疫苗的制备方法，其中包括如下特征构建成微小RNA145‑5p的基因片段，重组到载体质粒上后通过脂质体转染人未成熟树突状细胞，其负载肿瘤细胞裂解抗原，制备成树突状细胞疫苗；微小RNA145‑5p在树突状细胞中过表达从而抑制免疫负调控作用的信号调控蛋白α的表达，促进树突状细胞适应性免疫活性，即增强了其表达共刺激分子、分泌细胞因子能力和激活毒性T淋巴细胞活性的能力，可引发体内体外试验更强的抗肿瘤毒性。

主权项

一种抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：构建成微小RNA145‑5p的基因片段，重组到载体质粒上后通过脂质体转染人未成熟树突状细胞，其负载肿瘤细胞裂解抗原，制备成树突状细胞疫苗；所述微小RNA145‑5p在树突状细胞中过表达从而抑制免疫负调控作用的信号调控蛋白α的表达，增强了树突状细胞的适应性免疫活性；所述微小RNA145‑5p的基因片段为成熟体微小RNA145，上下游各延长200个碱基，并在5’端和3’端加入限制性酶切位点，构建成微小RNA145‑5p重组片段；其中，重组mir145‑5p/pcDNA4基因构建的制备包括步骤如下：将合成熟体微小RNA145‑5p基因序列24个碱基，及其上下游各200个碱基与5’端Kpn I和3’端EcoR I的识别序列构成的基因序列通过化学合成获得，即mir145‑5p；将mir145‑5p的目的DNA片段和pcDNA4载体Kpn I和EcoR I双酶切后，在T4 DNA连接酶作用下，将两者于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆的PCR鉴定和测序鉴定，即mir145‑5p/pcDNA4；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合mir145‑p5大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含氨苄的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒通过核酸定量仪确定DNA浓度，用去离子水稀释到4ug/μl，然后将重组载体DNA放置‑80℃超低温冰箱中长期保存。