[发明专利]一种血清中免疫球蛋白G糖肽的绝对定量分析方法

摘要

本发明提供了一种绝对定量血清中免疫球蛋白G(IgG)糖肽的定量方法。工艺过程包括血清中IgG糖肽的释放，色谱法对IgG糖肽的富集。将收集到的IgG糖肽分成二份，一份进行IgG糖肽中各种糖型Profiling分析；另一份IgG糖肽进行PNGase F酶解，对去糖基化的IgG肽段进行MRM定量分析；结合Profiling结果计算IgG各种糖型对应糖肽含量。本发明方法可以测量血清中IgG各亚型上每种糖肽的摩尔浓度，方法灵敏度高，精密度好，准确率高，回收率高，可操作性好，适合血清中IgG糖肽高通量绝对定量研究。

主权项

1.血清中免疫球蛋白G糖肽绝对定量方法，其特征在于，包括以下步骤：1)血清酶解：用缓冲溶液将血清稀释，然后加入二硫苏糖醇进行二硫键还原，反应产物中加入碘代乙酸，得到反应液，将反应液中加入胰蛋白酶进行酶解反应；2)免疫球蛋白G糖肽富集：酶解液进行一维色谱富集，经nano‑ESI‑Q‑TOF分析，洗脱得到免疫球蛋白G糖肽组分；将收集的免疫球蛋白G糖肽分成两份；3)免疫球蛋白G糖肽Profiling分析：将步骤2)中收集的免疫球蛋白G糖肽中的一份进行HPLC‑MRM分析：将免疫球蛋白G亚型中各糖肽峰面积归一化到与其对应亚型总糖肽峰面积之和，即可得到免疫球蛋白G亚型中各糖肽占该亚型总糖肽的百分比；4)糖链释放：将步骤2)中收集的免疫球蛋白G糖肽另一份进行PNGase F酶解反应，从而得到去糖基化的免疫球蛋白G肽段酶解液；5)去糖基化免疫球蛋白G肽段HPLC‑MRM定量分析：将步骤4)中免疫球蛋白G糖肽的PNGase F酶解液进行HPLC‑MRM定量分析；具体地，先建立免疫球蛋白G亚型的内标曲线；采用所述免疫球蛋白G亚型的一种或两种以上亚型，在上述一种或两种以上亚型中选取各亚型中的任一糖肽对应肽段作为标准品，即1～4个标准品，一起稀释成至少5个不同浓度，浓度范围为20ppb‑200ppm，每个浓度的标准品均加入1ppm～4ppm与各标准品等体积的与亚型对应的内标肽段，所述内标肽段与标准品的区别在于内标肽段在上述液相分离条件下具有与标准品相似保留行为；而后进行HPLC‑MRM定量分析，建立与上述亚型对应的内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的摩尔浓度；而后，将步骤4)酶解液中加入与该酶解液等体积的1ppm～4ppm所述内标肽段，进行HPLC‑MRM定量分析，测定步骤4)酶解液中免疫球蛋白G亚型中与标准品对应的肽段峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，将此比值带入内标曲线，得到该亚型总肽段摩尔浓度，即为该免疫球蛋白G亚型总糖肽的摩尔浓度；6)免疫球蛋白G亚型中每种糖肽浓度计算：将步骤3)中得到的免疫球蛋白G亚型中各糖肽占亚型总糖肽的百分比，与步骤5)中得到的免疫球蛋白G亚型总糖肽的摩尔浓度的乘积，即为一种或两种以上免疫球蛋白G亚型中的各糖肽的摩尔浓度。