[发明专利]无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法

摘要

无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法，其特征有以下步骤a.进行牙龈组织样本取样，样本为牙龈切除术的牙龈健康的患者，年龄20~62岁，对患者口腔进行局部麻醉，清洗口腔，用碘伏全面消毒后，做出切口标记线，角形切口，按标记线切开后，切除牙龈；本发明的优点是最小化疾病传播的风险。

主权项

无血清培养人牙龈间充质干细胞的方法，其特征在于：a.进行牙龈组织样本取样，样本为牙龈切除术的牙龈健康的患者，年龄20~62岁，对患者口腔进行局部麻醉，清洗口腔，用碘伏全面消毒后，做出切口标记线，角形切口，按标记线切开后，切除牙龈，将其置入10mL无菌1640 RPMI 培养液中，进行充分的摇晃后静止，送于实验室培养；b.准备好材料：MesenGro无血清培养基、MEM‑α培养基、RPMI1640培养基、谷氨酰胺、胰蛋白酶、胎牛血清、鼠抗人CD3抗体，丝裂霉素C、地塞米松、吲哚美辛、IBMX、胰岛素、抗坏血酸Vit C和β‑甘油磷酸钠；c.获取健康成人的健康牙龈组织，用RPMI 1640冲洗干净，利用终浓度2 mg/mL 的dispaseⅡ消化8~12h后，加终浓度4 mg/mL 的collagenase Ⅳ在37℃温度下消化2 h，获取单个核细胞，10%浓度的 FBS MEM‑α培养基培养牙龈间充质干细胞，当细胞长至80%~90%融合后，用0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA 37℃消化2 min，传代培养逐渐转移至MesenGro无血清完全培养基中，台盼蓝未染色细胞存活率＞95%；d.利用FACSCalibur流式细胞仪鉴定牙龈间充质干细胞表型，包括HLA‑DR、CD29、CD33、CD34、CD73、CD105、CD90、CD86，在生长良好的牙龈间充质干细胞中加入标准的含有含地塞米松0.5 umol/L、吲哚美辛100 mmol/L、IBMX 0.5 mmol/L、胰岛素10 mg/L、10% FBS MEM‑α培养基成分的成脂诱导剂，在第21天进行油红O染色，相差显微镜下观察脂肪小滴形成情况；加入含有含抗坏血酸Vit C50 ug/mL，地塞米松107 mol/L，β‑甘油磷酸钠10 mmol/L、10% FBS MEM‑α培养基的矿化诱导液，第21天用0.1 %茜红染色，相差显微镜下观察矿化结节形成情况；e.先用紫外光照射96孔酶标板，对96孔酶标板进行杀菌处理，取对数生长期的10% FBS MEM‑α 、 MesenGro无血清培养的GMSCs以103 cells/孔接种于96孔板内，每孔0.1 mL，24 h、48 h、72 h、96 h、108 h后，每孔加入10 μL CCK8，继续培养2 h后，酶标仪波长450 nm处检测吸光度（A）值，实验重复3次；f.将第3代10%FBS MEM‑α、MesenGro无血清培养GMSCs接种于96孔板，培养24小时，第2日取新鲜外周血10 mL，利用密度1.077±0.001 g/mL的淋巴细胞分离液，分离获得单个核细胞2×107，将细胞重悬于10% FBS RPMI 1640培养基，将贴壁的GMSCs与PBMC按梯度比例共培养，梯度比例分别为GMSCs：PBMC为1:1、 1:5、1:25、 1:50、1:100、1:200，经过mitomycin处理的APC细胞和人CD3抗体刺激3 d后，将悬浮的PBMC转移至新的96孔培养板中，细胞悬液加入10 μL CCK‑8，继续培养2 h后，450 nm波长下测量OD值确定增殖后的PBMC量，并计算GMSCs对PBMC增殖的抑制率，抑制率=[（对照组‑实验组）/对照组]×100%。