[发明专利]一种化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法

摘要

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法。其原理是以鲁米诺还原氯金酸，得到鲁米诺胶体金纳米粒子LumAuNPs，以适体互补序列DNA修饰LumAuNPs，得化学发光探针；以磁珠为载体固定适体DNA，得DNA修饰磁珠；再将化学发光探针与DNA修饰磁珠孵育得化学发光传感器；在目标物糖化血红蛋白存在时，适体DNA与糖化血红蛋白作用，化学发光探针从磁珠表面脱落；经过磁分离后，在分离液中加入羟胺‑O‑磺酸，以LumAuNPs—羟胺‑O‑磺酸为化学发光体系，进行化学发光测定，根据产生的化学发光实现目标糖化血红蛋白的测定。方法具有简单、灵敏度高的优势。

主权项

1.一种非诊断目的的化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法，其特征在于以鲁米诺还原氯金酸，得到鲁米诺胶体金纳米粒子LumAuNPs，以适体互补序列DNA修饰LumAuNPs，得化学发光探针；以磁珠为载体固定适体DNA，得适体DNA修饰磁珠；再将化学发光探针与适体DNA修饰磁珠孵育得化学发光传感器；在目标物糖化血红蛋白存在时，适体DNA与糖化血红蛋白作用，化学发光探针从磁珠表面脱落；经过磁分离后，在分离液中加入羟胺‑O‑磺酸，以LumAuNPs—羟胺‑O‑磺酸为化学发光体系，进行化学发光测定，根据产生的化学发光实现目标糖化血红蛋白的测定，具体步骤：(1)鲁米诺胶体金纳米粒子的制备：实验开始前，将所用的玻璃仪器用HNO3/HCl体积比为3:1的王水浸泡24h后，用二次蒸馏水冲洗，放入烘箱烘干；取一定量的1％的氯金酸溶液加去离子水稀释成0.02％的氯金酸溶液并置于三口烧瓶中，在磁力搅拌下加热回流煮沸；待溶液沸腾后，快速加入0.01mL～5mL 0.01M的鲁米诺溶液，继续加热煮沸，溶液的颜色由浅黄色变为黑色，最后变成酒红色，40min后停止加热，并在继续搅拌下冷却至室温，得鲁米诺胶体金纳米粒子，即LumAuNPs，将制得的LumAuNPs转移到棕色广口瓶中，4℃下保存备用；(2)适体DNA修饰磁珠的制备：取10μL～100μL羧基化磁珠溶液放入1.5mL离心管中，用10μL～200μL浓度为0.1M咪唑缓冲液洗涤三次，然后分散到0.01mL～2mL含有0.1M EDC和0.05M NHS的0.1M咪唑缓冲液中，在37℃条件下，振荡反应30min；然后向离心管中加入10μL～200μL浓度为5.0×10‑8M适体DNA，在37℃条件下振荡过夜，得到适体DNA修饰磁珠，然后再用2.0mL 0.1M PBS缓冲溶液清洗三次，最后分散到2.0mL PBS缓冲溶液中，4℃保存；(3)适体互补序列DNA修饰LumAuNPs的制备：将1μL～20μL的TCEP加到10μL～200μL浓度为1.0×10‑6M的适体互补序列DNA溶液中，37℃振荡活化1小时，再取100μL～1000μL合成好的LumAuNPs加入到该溶液中，在37℃条件下震荡过夜，然后再加入10μL～200μL含0.3M NaCl pH 8.2的10mM Tris‑HCl缓冲液；继续震荡48h后，在12000rpm的条件下离心30min后，将红色沉淀用1mL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液清洗，再次离心，如此重复三次，得适体互补序列DNA修饰LumAuNPs，即化学发光探针；最后得到的化学发光探针分散到1000μLpH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，4℃保存备用；(4)糖化血红蛋白的检测：取10μL～200μL适体DNA修饰磁珠溶液置于离心管中，然后在此离心管中加入10μL～100μL化学发光探针溶液，37℃条件下震荡反应40min后，磁分离，将磁性分离物分散在10μL～100μL含目标物糖化血红蛋白的溶液中，37℃震荡反应40min，经过磁分离后，将磁性分离液分散在50μLpH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，然后再加入羟胺‑O‑磺酸溶液，产生化学发光，根据化学发光强度定量，实现糖化血红蛋白的测定；所述的DNA序列如下：适体DNA为：5`‑NH2‑ACACAGCAACACACCCACCCACCAGCCCCAGCATCATGCCCATCCGTCGTGTGTG‑3`；适体互补序列DNA为：5’‑SH‑CACACACGACGGATGGGCATGATGCTGGGGCTGGTGGGTGGGTGTGTTGCTGTGT‑3’。