[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术制备水稻OsPIL15突变体的方法及应用

摘要

本发明涉及一种基于CRISPR/Cas9技术制备水稻OsPIL15突变体的方法及应用，属于植物基因工程技术领域。本发明依据CRISPR/Cas9技术原理对水稻光敏色素互作因子OsPIL15进行定向编辑，设计OsPIL15突变靶点，构建CRISPR/Cas9‑gRNA(pBUN411‑gRNA)表达载体，利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴，以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株，利用酶切法和测序法分析鉴定突变单株。获得了一套具有重要应用价值的水稻ospil15突变体新种质，突变体后代籽粒粒长极显著增加，平均增幅达4.79％，可应用于水稻高产、稳产育种。

主权项

一种基于CRISPR/Cas9技术制备水稻OsPIL15突变体的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)gRNA靶点序列的选择：序列为5′‑GACTTCTTCTCCGAGCTCCAGG‑3′，所述序列3′端的PAM序列为AGG，限制性内切酶SacⅠ识别序列为5′‑GAGCTC‑3′；2)gRNA寡核苷酸链上下游引物的设计：上游引物为sgRNA‑F：5′‑GGCGGACTTCTTCTCCGAGCTCC‑3′，下游引物为sgRNA‑R：5′‑AAACGGAGCTCGGAGAAGAAGTC‑3′；3)gRNA表达载体构建：将所述上下游引物混合、退火，得寡核苷酸双链DNA；用内切酶BsaⅠ酶切pBUN411质粒，得线性质粒；用T4连接酶将所述线性质粒和寡核苷酸双链DNA连接，得连接产物；将连接产物转化、筛选、验证，即得pBUN411‑gRNA表达载体；4)将pBUN411‑gRNA表达载体导入农杆菌中，得CRISPR/Cas9‑gRNA农杆菌；用CRISPR/Cas9‑gRNA农杆菌侵染水稻愈伤组织；5)将步骤4)获得的愈伤组织诱导得到再生苗，筛选得到转基因阳性植株，鉴定即得水稻OsPIL15突变体。