[发明专利]一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法

摘要

本发明涉及一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法，该方法包括以下步骤：⑴黄粉虫虫卵的收集：黄粉虫成虫经避光产卵、孵育，获得孵育后黄粉虫虫卵；⑵黄粉虫虫卵的灭菌：无菌条件下颗粒饱满孵育后黄粉虫虫卵经消毒、冲洗、漂洗，获得无菌虫卵；⑶获取黄粉虫胚胎的组织和细胞：在无菌条件下无菌虫卵挑至细胞筛，并将该细胞筛置于培养皿中，加入细胞培养液，研碎卵粒，获得细胞滤液；⑷黄粉虫胚胎细胞的原代培养：细胞滤液静置培养，15~40天后即可得到贴壁生长的黄粉虫胚胎细胞群；⑸黄粉虫胚胎细胞的传代培养：弃去原代细胞培养液，黄粉虫胚胎细胞群经消化、吹打分散细胞、静置培养，7~10天后即可进行下次传代。本发明操作简便、方法易行、细胞成活率高。

主权项

一种黄粉虫胚胎细胞的原代培养方法，包括以下步骤：⑴黄粉虫虫卵的收集：将黄粉虫成虫置于7~12目筛，筛底部铺满饲料，使饲料与筛底相接触，在25℃~28℃条件下，避光产卵；次日，从饲料中16~20目筛筛取虫卵，然后剔除虫卵中杂质；在25℃~28℃条件下，孵育3~7天，获得孵育后黄粉虫虫卵；⑵黄粉虫虫卵的灭菌：无菌条件下，将900~1100粒颗粒饱满所述孵育后黄粉虫虫卵裹于双层无菌纱布，先浸于质量浓度为10%的NaClO溶液中消毒6min~8min，然后浸于体积浓度为75%的酒精消毒5min~6min，接着用至终浓度为200 U/mL双抗和2.5μg /mL两性霉素B的无菌水冲洗2~4次，再用Grace’s昆虫培养基漂洗1~4次，获得无菌虫卵；⑶获取黄粉虫胚胎的组织和细胞：在无菌条件下，用镊子将所述无菌虫卵从纱布上挑至孔径为100μm的细胞筛，并将该细胞筛置于培养皿中，加入8~10mL细胞培养液，用橡胶头研碎卵粒，获得细胞滤液；⑷黄粉虫胚胎细胞的原代培养：吸取2.5 mL所述细胞滤液移入装有2.5 mL细胞培养液的T‑25cm2培养瓶中，置于28℃普通培养箱中静置培养，每隔7~14d天更换60%~80%的细胞培养液，15~40天后即可得到贴壁生长的黄粉虫胚胎细胞群；⑸黄粉虫胚胎细胞的传代培养：弃去原代细胞培养液，在所述黄粉虫胚胎细胞群中加入2mL质量浓度为0.25%的胰蛋酶‑EDTA消化液，室温消化30min，倒掉消化液，加入2.5mL细胞培养液，吹打分散细胞，获得细胞悬液；将所述细胞悬液全部移入新T‑25cm2培养瓶，再加入2.5mL细胞培养液，放于28℃普通培养箱中静置培养，7~10天后，细胞贴满平底，即可进行下次传代。