[发明专利]一种植物基因组多位点编辑载体pCXUN-CAS9-RGR

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种植物基因组多位点编辑载体pCXUN‑CAS9‑RGR。本发明利用CRISPR/CAS9技术结合RGR高效转化水稻敲除相关基因得到一种载体，该载体被命名为pCXUN‑CAS9‑RGR。所述的载体包含有如序列表SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。本发明利用RGR方法突变水稻靶基因得到高效转化载体，是一种一元载体，本发明的编辑载体可用于定向多靶位点突变水稻靶基因，研究水稻中相关基因的功能和作用，也可以用于构建相应的基因突变体和大片段缺失。本发明的载体具有很高的转化效率和打靶突变效率，可以在水稻中稳定遗传及应用。

主权项

1.一种植物基因组多位点编辑载体pCXUN‑CAS9‑RGR，其特征包括，该载体通过下列步骤制备获得：(1)以SEQ ID NO：1所示的序列的起始载体pCXUN为材料，用Xcm1切除该载体中的登陆号为NC_007635.1的ccd基因；(2)在步骤(1)Xcm1切除了载体ccd基因的位置，即744‑438碱基位上定向插入SEQ ID NO：4所示的CAS9基因片段，得到如SEQ ID NO：4所示的中间载体pCXUN‑CAS9；(3)将步骤(2)中所得到的中间载体pCXUN‑CAS9，用KpnI&SacI消化成线性DNA，引入两个RGR，所述的RGR的引入为下列方式:1)首先选择靶基因特异性序列gRNA，用NEB Cutter软件在http://nc2.neb.com/NEBcutter2/网站界面上输入目的基因序列，或者从相关网站上筛选找到23nt的靶序列：N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20NGG，其中N代表任意碱基；2)通过PCR将以下片段中的Hammerhead Ribozyme即锤头核酶序列置于gRNA的5’端，将D型肝炎病毒核酶序列置于gRNA的3’端，得到人工合成的RGR序列单元，具体序列如下所示：N¹N²N³N⁴N⁵N⁶N⁷N⁸N⁹N¹⁰N¹¹N¹²N¹³N¹⁴N¹⁵N¹⁶N¹⁷N¹⁸N¹⁹N²⁰GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT最后以该RGR序列单元为模板得到携带靶基因的RGR‑基因，将靶位点的两个RGR通过重叠PCR串在一起形成RGR‑基因1+RGR‑基因2；其中所述的插入片段中：波浪线的碱基部分为靶基因序列前六个碱基的互补配对序列，长度为1‑6bp；斜体碱基部分为Hammerhead Ribozyme即锤头核酶序列，长度为7‑42bp；方框碱基部分为D型肝炎病毒的核酶序列，长度为176‑243bp；下划线的碱基部分是设计的基因靶位点序列，长度为43‑62bp；GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT是gRNA核心序列，长度为63‑175bp；M⁶M⁵M⁴M³M²M¹与N¹N²N³N⁴N⁵N⁶补配对；3)选择Rice U6或U3或其他不同类型启动子通过重叠PCR引入在RGR序列单元的5’端，得到启动子‑RGR‑基因1‑RGR‑基因2片段；所述的U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的U3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；4)用Gibson一步快速连接法将U6或U3‑RGR‑基因1‑RGR‑基因2连接到线性化载体pCXUN‑CAS9中，得到转化载体pCXUN‑Cas9‑RGR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示。