[发明专利]一种动物性食品中79种抗菌药物的筛查方法

摘要

本发明公开了一种动物性食品中79种抗菌药物的筛查方法，具体包括以下步骤标准工作溶液的配制，待测样品的分析前处理标准曲线的绘制，定性分析和定量分析。本发明搭建的高通量筛查和定量的检测平台，使得在本领域内从检测单一化合物向同时检测多种化合物的方向发展，与原有的技术相比，检测成本仅为原有的二分之一左右，样品的检测周期缩短为原来的一半，极大提高了工作效率。本发明建立筛查技术在农业部实施的兽药残留监控计划、无公害畜产品检测计划以及全国畜产品例行检测计划等活动中发挥了有效的作用。

主权项

一种动物性食品中79种抗菌药物的筛查方法，其特征在于：具体包括以下步骤：所述79种抗菌药物为：(a)磺胺类：磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺吡啶、磺胺二甲唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺甲氧嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺噻唑；(b)头孢类：头孢喹肟；(c)四环素类：土霉素、四环素、金霉素；(d)酰胺醇类：氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素；(e)大环内酯类：泰乐菌素、替米考星、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、吉他霉素A5；(f)林可胺类：林可霉素、克林霉素；(g)氟喹诺酮类：恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星、那氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、萘啶酸、西诺沙星、洛美沙星、氧氟沙星、恶喹酸、氟甲喹、依诺沙星；(h)硝基咪唑类：奥硝唑、替硝唑、地美硝唑、罗硝唑、甲硝唑、卡硝唑；(i)抗病毒类：金刚烷胺、金刚乙胺；(j)镇定剂类：氟哌利多、氟哌啶醇、阿扎哌隆、异丙嗪、地西泮；(k)解热镇痛类：对乙酰氨基酚、安替比林、氨基比林；(l)β‑受体激动剂类：莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗、福莫特罗、拉贝特罗、喷布特罗、妥布特罗、西马特罗、齐帕特罗、氯丙那林；(m)其他类：阿托品、泰妙菌素、氨苯砜、甲氧苄啶；(1)标准工作溶液的配制：准确称取各标准品10mg，于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成1mg/mL各标准贮备液；对于难溶药物，恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星加入少量0.1mol/L HCl溶液，洛美沙星加入少量0.1mol/L NaOH溶液，头孢喹肟加适量二甲基亚砜使其溶解后，用甲醇定至刻度；量取各标准贮备液至100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制得混合标准中间溶液；其中磺胺类、氟喹诺酮类、林可胺类、氨苯砜、泰妙菌素和甲氧苄啶各取0.4mL；解热镇痛类和金刚乙胺各取2mL；头孢喹肟取4mL；四环素类、泰乐菌素、替米考星、吉他霉素A5、奥硝唑和金刚乙胺各取1mL；β‑受体激动剂类、酰胺醇类、阿托品、氟哌利多和氟哌啶醇各取0.2mL；阿扎派隆、异丙嗪和地西泮各取0.1mL；移取混合标准中间溶液0.1mL、0.2mL、0.5mL分别至10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制得LOQ浓度混合标准工作溶液、2LOQ浓度混合标准工作溶液和5LOQ浓度混合标准工作溶液；(2)待测样品的分析前处理：1)提取：称取均质试样2±0.02g于50mL聚丙烯离心管中，先后加入Na2EDTA溶液和乙腈、甲醇、乙酸乙酯溶液，涡旋10‑30s混匀，振荡10‑30min；以5000‑8000r/min转速离心5min，上清液转移至50mL聚丙烯离心管中；加入提取液对残渣进行重复提取，合并提取液；并于40‑50℃下氮吹至溶液剩余约1‑2mL；作为备用液；2)净化：采用Agela Cleanert PEP‑2固相萃取柱分别用5‑8mL甲醇和3‑6mL水活化，将备用液全部过柱，控制流速为约1‑3滴/s；用淋洗液淋洗，真空抽干3‑5min；用洗脱液洗脱，洗脱液于30‑40℃下氮气吹干；准确加入20％乙腈水溶液1‑3mL溶解定容，涡旋混匀后过0.22μm微孔尼龙滤膜；(3)标准曲线的绘制：精密量取1μg/mL混合标准溶液适量，空白试样基质溶液配制成浓度为1、2、5、10、20、50、100ng/mL的系列标准溶液，供液相色谱‑串联质谱测定；以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，相对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，获得79种抗菌药物的定性分析色谱图库；(4)对步骤(3)所述的含有各个药物定量限LOQ的2LOQ浓度的试样进行质谱分析，获得各个药物的准分子离子，以及两个特征离子：定性离子和定量离子，如下表所示：(5)定性分析：对经过步骤2)所述方法处理的待测样品选择1个母离子和2个特征离子，进行一次性液相色谱分析，样品中待测物的保留时间与步骤3)所得谱图库中对应的保留时间偏差在±2.5％之内，且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过下表规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物：相对离子丰度(％)>50>20～50>10～20≤10允许的最大偏差(％)±20±25±30±50(6)定量分析：在仪器最佳工作条件下，取经过步骤2)所述方法处理的待测样品和步骤1)所制备的混合标准工作液进行质谱分析，得到色谱峰面积响应值，作单点或多点校准，用外标法定量；待测样品溶液中待测物的响应值和混合标准工作也中各待测物的特征离子的响应值均应在仪器测定的线性范围内，若待测样品溶液浓度超过线性范围时，用乙腈/水(V/V，20:80)溶液稀释后重新测定；试样中各药物含量X以质量分数计，单位为毫克每千克(mg/kg)，按公式(1)计算：X=A×Cs×V×V2As×m×V1×n---(1)]]>式中：A—待测样品溶液中待测物的峰面积；As—混合标准工作液中相应待测物的峰面积；Cs—混合标准工作液中待测物浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；V—溶解残余物的体积，单位为毫升(mL)；m—样品的质量，单位为克(g)；V1—过固相萃取柱的提取液体积，单位为毫升(mL)；V2—总提取液体积，单位为毫升(mL)；n—稀释倍数。测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。