[发明专利]一种液态发酵法制备纳豆激酶的方法

摘要

本发明公开了一种液态发酵法制备纳豆激酶的方法，包括：菌种活化、培养基制备、种子制备、接种、变温发酵、后处理等单元操作。该方法是集菌种活化、培养基制备、种子制备、接种、发酵、后处理等为一体，整个过程是在洁净或无菌环境中进行，不会产生跑、冒、滴、漏等不良现象，易于达到GMP要求。与传统法相比，本发明具有如下特点：巧妙的多组分培养基组方设计，为纳豆激酶产生菌的生长提供了良好的物质基础；表面活性剂的采用，使纳豆激酶的产生与分泌明显提高；变温发酵方法及工艺的应用，使纳豆激酶的产率提高6‑38%；工艺合理先进，便于扩大再生产，产量和质量明显提高，且利于环保。本发明可广泛用于纳豆激酶及其它相关产品的研发和生产。

主权项

一种液态发酵法制备纳豆激酶的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：⑴纳豆芽孢杆菌菌种的活化；⑵发酵培养基的制备；⑶纳豆芽孢杆菌种子的制备；⑷接种；⑸变温发酵；(6)后处理得产品；其中，所述的发酵培养基：包括如下质量的成分（g/L）：大豆全粉10‑180、葡萄糖2‑40、蔗糖3‑45、甘氨酸2‑76、丙氨酸1‑49、丝氨酸5‑56、赖氨酸3‑58、天门冬氨酸5‑50、组氨酸2‑46、亮氨酸1‑38、大豆蛋白肽0.05‑6.0、生物素0.01‑1.8、Vc 0.05‑4.0、Ve 0.04‑4.0、Vb5 0.05‑6.0、烟酸0.03‑4.0、烟酰胺0.05‑4.0、牛磺酸0.05‑4.0、L‑半胱氨酸或其盐酸盐0.05‑4.0、L‑胱氨酸0.04‑4.0、肝素钠0.02‑3.0、精氨酸0.03‑4.0、谷氨酸0.02‑4.0、吐温‑80 0.05‑4.0、酪蛋白酸钠0.8‑18.0、辅酶Q10 0.02‑4.0、 MgSO4·7H2O 0.3‑6、CaCl2 0.2‑4，余量：去离子水，pH值=6.8‑7.4；具体的方法步骤为：⑴纳豆芽孢杆菌菌种的活化在无菌环境下，将保藏的纯种纳豆芽孢杆菌菌种用接种环挑取1环在常规试管斜面培养基上划线接种，于36‑38℃培养箱中培养24‑32h后，挑取生长良好的单菌落涂布到新的试管斜面上，36‑38℃培养箱中培养24‑32h后即可得到活化的纳豆芽孢杆菌菌种；⑵发酵培养基的制备发酵培养基的制备方法：包含以下工艺步骤：.按本专利所述的配方和配方量分别称取或量取各组分并将其按对温度的敏感性分为3组：A组（耐高温——包括配方中的大豆全粉、大豆蛋白肽、氨基酸和无机盐），B组（较耐高温——包括配方中的2种糖、吐温‑80 和酪蛋白酸钠）和C组（敏感组分——包括配方中的全部维生素），备用；.将称取或量取的A组各组分在无菌条件下混合在一起，加入适量的水混合均匀后在121℃灭菌20‑40min；.将称取或量取的B组各组分在无菌条件下混合在一起，加入适量的水混合均匀后在115℃灭菌15‑30min；.将称取或量取的C组各组分在无菌条件下根据其溶解性用适量的溶剂溶解后无菌过滤，将所得滤液收集在一起，备用；.在无菌条件下，将C组滤液加入到灭过菌的A+B组组分中，搅拌混合均匀即得所述生产纳豆激酶的培养基，备用；⑶纳豆芽孢杆菌种子的制备在无菌条件下，向活化后的纳豆芽孢杆菌斜面试管里加入2‑5ml无菌水制备菌悬液，然后，分装到1～2个装有灭过菌的发酵培养基的三角瓶中，在38℃、180r/min条件下振荡培养10‑20h作为发酵种子，备用；此后，根据生产规模的大小，按10‑20倍的放大倍数进行发酵用种子的1、2、3级扩培；⑷接种将制备好的种子在无菌条件下按质量比为0.5‑25%的比例接入发酵培养基中；⑸变温发酵将接过种的培养基置于液态控温发酵罐中，装料系数为0.6‑0.85，然后在转速为100‑240rpm温度为42‑45℃发酵2‑4h，36‑38℃培养20‑30h，20‑28℃培养18‑26h；(6)后处理采用的后处理的方法包括发酵结束后对其进行均质化处理，然后经调配灌装检验至得到产品；或对发酵液浓缩干燥粉碎后的固态产品；或对发酵液进行分离纯化以得到精细化产品。