[发明专利]条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法

摘要

本发明公开了一种条形叶植物叶绿体DNA的提取方法，包含如下步骤：A、通过在叶片上制造机械创伤并结合酶解处理手段获取叶片原生质体，所得原生质体中含有叶绿体、线粒体和细胞核；B、通过差速离心处理去除步骤A所得产物中的杂物对叶绿体进行粗提；C、通过密度梯度离心去除步骤B所得产物中的杂物对叶绿体进行纯化；D、采用天根生化快捷型植物基因组DNA提取系统对步骤C所得产物进行提取，获取高纯度的叶绿体DNA。本发明的方法能够对条形叶植物叶绿体DNA进行高纯度、高质量的提取。

主权项

1.条形叶植物叶绿体DNA的高纯度高质量提取方法，其特征在于：该方法通过在叶片上制造机械创伤并结合酶解处理手段获取叶片原生质体，所得原生质体中含有叶绿体、线粒体和细胞核；该方法在获取叶片原生质体后，通过密度梯度离心和差速离心相结合的手段同时将线粒体和细胞核去除干净；该方法包含如下步骤：A、叶片原生质体分离：通过在叶片上制造机械创伤并结合酶解处理手段获取叶片原生质体，所得原生质体中含有叶绿体、线粒体和细胞核；B、叶绿体的粗提：通过差速离心处理去除步骤A所得产物中的杂物对叶绿体进行粗提；C、叶绿体的纯化：通过密度梯度离心去除步骤B所得产物中的杂物对叶绿体进行纯化；D、叶绿体DNA的提取：采用快捷型植物基因组DNA提取系统对步骤C所得产物进行提取，获取高纯度的叶绿体DNA；步骤A包含如下分步骤：A‑1、叶片组织的培养与获取：将目的植物的种子种于育苗盘，并于抽穗前剪取新鲜、健康叶片；A‑2、叶片组织的处理：用刀片将步骤A‑1所得叶片沿纵和/或横方向进行交叉切割，造成密集的纹状或格状创伤面，以利后续处理；A‑3、原生质体的分离：将步骤A‑2处理好的叶片置于酶解液中，使酶解液淹没叶片，于黑暗中用脱色摇床30 rpm摇动处理3 h；叶片与酶解液比例为30g：50‑150mL；A‑4、原生质体的收集：用buffer 1 稀释步骤A‑3所得酶解物后，用200目细胞筛过滤，收集滤液，弃渣；滤液4 ^oC 、200 g，离心10 min，收集沉淀，即得；所述酶解液的配方如下表所示：纤维素酶0.5 g/100mL离析酶0.3 g/100mLMannitol0.4 MKCl20 mMMES, pH=5.720 mM55 ^oC 加热 10 min，冷却后 CaCl₂10 mMBSA0.1 g/100mL。