[发明专利]具有DPP-Ⅳ抑制功能的鱼皮蛋白肽及其制备方法与应用

摘要

本发明提供一种具有DPP‑Ⅳ抑制功能的鱼皮蛋白肽，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。本发明针对目前鱼类加工产业的快速发展，鱼皮蛋白资源数量的快速增加，根据鱼皮蛋白的特性，以鱼皮为原料，通过对鱼皮超声波和高温高压等预处理，利用多种蛋白酶分步酶解技术，通过膜分离、凝胶分离及高效液相色谱分离技术，所得鱼皮蛋白肽粉中序列如SEQ ID NO:1和2所示的鱼皮蛋白肽的含量占鱼皮蛋白肽粉总重的50％以上，建立了一套简单高效的具有DPP‑Ⅳ抑制功能的鱼皮蛋白肽的制备方法。

主权项

1.含有具有DPP-Ⅳ抑制功能的鱼皮蛋白肽的鱼皮蛋白肽粉，其特征在于，所述鱼皮蛋白肽粉的制备方法包括以下步骤：/n(1)将冷冻鱼皮在8-12℃条件下进行解冻清洗，鱼皮清洗后用打浆机将鱼皮打成浆，加入鱼皮重量1.5-2.5倍的水，于125-135℃保温30-60分钟；/n(2)将鱼皮蛋白浆的温度下调至60-70℃，进行超声处理；超声处理在超声波发生器内进行，超声波的频率为70-90kH，处理时间25-35分钟；/n(3)将经过超声后鱼皮蛋白浆的温度上调至115-125℃，于115-125℃煮制150-180分钟，然后离心取上清液；/n(4)按照鱼皮重量0.10-0.20％的比例向(3)的上清液中加入复合蛋白酶进行分步酶解：第一步向上清液中加入鱼皮重量0.05-0.10％的复合蛋白酶I，于50-65℃酶解1.0-2.0h；第二步向上述酶解体系中加入鱼皮重量0.05-0.10％的复合蛋白酶II，于55-65℃酶解1.0-2.0h；然后在95-98℃下保温10-20分钟，冷却至室温，用活性炭过滤，收集上清液；/n(5)对步骤(4)所得上清液进行超滤处理，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，将分子量小于5000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的滤滤膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来；/n(6)分子量小于3000的蛋白肽液再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，取第15-17分钟收集的肽溶液；/n(7)将步骤(6)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到含有序列如SEQ ID NO:1和2所示的鱼皮蛋白肽的鱼皮蛋白肽粉；SEQ ID NO:1和2所示的鱼皮蛋白肽的含量占鱼皮蛋白肽粉总重的52-55％；/n其中，步骤(4)的复合蛋白酶I由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按质量比1:1-2组成，其中碱性蛋白酶的酶活为80-100万U/g，胰蛋白酶的酶活为50-60万U/g；复合蛋白酶II由菠萝蛋白酶和风味蛋白酶按质量比1:1组成，其中菠萝蛋白酶的酶活为20-30万U/g，风味蛋白酶的酶活为40-60万U/g；/n所述鱼皮来自鲢鱼、罗非鱼；/n所述碱性蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶购自丹麦诺维信公司，所述菠萝蛋白酶购自南宁庞博生物工程有限公司；/n步骤(6)RP-HPLC的条件为：0-5min，流动相为纯水；流动相B：含0.1％TFA的乙腈，5-10min流动相B，从0％到35％，10-15min，流动相B从65％到95％，15-30min，流动相B从95％到0％，30min停止；所用色谱柱为：Kromasil C18，5μm，4.6×250mm。/n